鹽度驟變對花鱸血清及肝臟代謝酶、抗氧化酶活力及皮質(zhì)醇含量的影響

王孝杉，方 秀，彭士明，汪 睛，施兆鴻

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.福建閩威實業(yè)股份有限公司，福建福鼎 355200）

海水魚類對鹽度的耐受性和適應(yīng)性與滲透壓調(diào)節(jié)能力和離子調(diào)節(jié)酶活力有關(guān)，在對鹽度的適應(yīng)過程中，魚類的生長、代謝、免疫、性腺發(fā)育等生理功能都會受到影響［1］。環(huán)境中鹽度變化可引起魚類多種生理應(yīng)激反應(yīng)，導致產(chǎn)生過量的活性氧分子［2］，影響到魚類的存活、代謝及免疫防御功能［3］。魚類機體中抗氧化系統(tǒng)的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，這3種酶協(xié)同作用，有效防護了活性氧對機體的損傷［4］，在清除活性氧自由基方面發(fā)揮著重要作用［5］。生物機體的部分新陳代謝活動是依賴不同磷酸酶來催化完成分子的磷酸化和去磷酸化［6］。其中，酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）是衡量受鹽度脅迫后機體免疫機能和健康狀況的重要指標［7］。而能反映受鹽度脅迫后機體應(yīng)激程度的轉(zhuǎn)氨酶主要存在于血液和肝臟等組織中，一般認為谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）是氨基酸代謝過程中兩個重要的氨基轉(zhuǎn)移酶［8］。同樣，皮質(zhì)醇（COR）不僅對應(yīng)激反應(yīng)和糖代謝有調(diào)控功能，對滲透壓也有調(diào)節(jié)作用，能通過增加氯細胞數(shù)量和提高Na＋-K＋-ATP酶活力來增強機體耐鹽性［9］?？梢姡寡趸负痛x酶活力以及皮質(zhì)醇含量對研究鹽度脅迫條件下的魚類適應(yīng)性和耐受性具有重要的意義。

花鱸（Lateolabraxmaculatus）是我國一種重要的經(jīng)濟魚類，其鹽度適應(yīng)范圍廣，在從淡水到高鹽海水等不同鹽度的水環(huán)境中均能存活生長［10］。有關(guān)鹽度變化對花鱸生長及生理生態(tài)影響的研究，20世紀90年代主要集中在鹽度對其胚胎和仔魚生長發(fā)育的影響方面［11－12］；21世紀以來開展了鹽度及饑餓脅迫相關(guān)實驗和研究［13－16］；近10年來研究則主要集中在鹽度脅迫對魚類生長性能、生理生態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、基因表達的影響等方面［17－25］。為評估花鱸在養(yǎng)殖環(huán)境中對鹽度驟變的耐受性和適應(yīng)性，本實驗設(shè)置鹽度驟降再驟升和鹽度驟升再驟降兩種處理方式，觀察其肝臟代謝酶和抗氧化酶活力及皮質(zhì)醇含量變化情況，旨在得出花鱸肝臟和血清中抗氧化酶和代謝酶活力以及皮質(zhì)醇含量在鹽度單一驟變及連續(xù)驟變過程中的響應(yīng)規(guī)律，并為花鱸應(yīng)對鹽度驟變的生理機制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚與實驗條件

實驗于2018年9月在東海水產(chǎn)研究所福鼎試驗基地進行。實驗用魚取自沙埕港內(nèi)的福建閩威實業(yè)股份有限公司養(yǎng)殖網(wǎng)箱，選取大小一致、活力較好的花鱸個體，平均體長（23.23±1.13）cm，平均體質(zhì)量（203.27±26.55）g。魚運抵后先在水溫（26.0±1.0）℃、鹽度20的室內(nèi)水泥池中暫養(yǎng)14 d。暫養(yǎng)密度為30尾·m－3，每天8∶00和17∶00飽食投喂日本林兼產(chǎn)業(yè)株式會社產(chǎn)“虎豚”牌2號配合飼料。不間斷向水中充氣，每天上午在投飼2 h后換同鹽同溫水50%，同時吸去底部污物及殘餌。實驗用水為過濾沉淀處理后的天然海水。

1.2 實驗設(shè)計

實驗在直徑1.2 m、深0.8 m的圓形玻璃纖維缸中進行。實驗設(shè)計見表1，鹽度驟變處理分A、B兩組：A組從鹽度18先驟降至鹽度為0的淡水并持續(xù)7 d，以A-Ⅰ表示；然后再驟升至鹽度33的水體中持續(xù)7 d，以A-Ⅱ表示；B組從鹽度18驟升至鹽度33的水體并持續(xù)7 d，以B-Ⅰ表示；然后再驟降到鹽度為0的淡水中并持續(xù)7 d，以B-Ⅱ表示。另設(shè)鹽度18養(yǎng)殖水體處理組為對照組（C組）。鹽度0的養(yǎng)殖水采用曝氣后的淡水；鹽度33的養(yǎng)殖水采用鹽度18的過濾沉淀后的天然海水添加海水晶配置，配制好的養(yǎng)殖水穩(wěn)定48 h后使用。用折光式PAL-03S鹽度計（愛拓牌，南京曉曉儀器設(shè)備有限公司）監(jiān)測養(yǎng)殖水的鹽度。每組均設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾魚。實驗期間的管理與暫養(yǎng)期間一致，每天觀察魚的活動和攝食狀況。

表1 鹽度驟變的實驗設(shè)置Tab.1 Experiment design of abrupt salinity changes

1.3 取樣和樣品檢測

第Ⅰ和第Ⅱ階段開始后分別于0、0.5、1、3、7 d時取樣，每個平行組每次取3尾魚。取樣前禁食半天，用3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽（MS-222，200 mg·L－1）將魚麻醉后，用1 mL注射器（預(yù)冷）從尾部靜脈抽取血液置入5 mL離心管中，離心管在4℃下靜置12 h，采用安信AXTGL16M型低溫離心機2 500 r·min－1條件下離心5 min，取上清液，置于2 mL離心管中放在－20℃冰箱中保存，用于檢測血清AKP、ACP、GPT、GOT活力和COR含量。取完血樣后將魚置于冰盤上解剖，取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水沖洗后再用吸水紙吸干，并置于2 mL的離心管中在－20℃冰箱中保存，用于檢測SOD、CAT、GSH-Px活力以及AKP、ACP、GPT、GOT活力。測定前，先將肝臟在勻漿介質(zhì)（pH 7.4，0.01 mol·L－1Tris-HCl，0.000 1 mol·L－1EDTA-2Na，0.01 mol·L－1蔗糖，0.8%NaCl）中剪碎，用滬析HR-6型勻漿機（15 000 r·min－1）研磨制成勻漿。在4℃、1 500 r·min－1條件下離心5 min。根據(jù)需要，取上清液稀釋后進行酶活力及總蛋白測定。總蛋白采用考馬斯亮蘭法（南京建成試劑盒）進行測定。酶活力用南京建成試劑盒檢測，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗結(jié)果用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計與分析。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和獨立樣本t檢驗對3個組別的差異性進行分析，當P＜0.05時表示差異具有顯著性，文中數(shù)據(jù)均以平均值±標準差（mean±SD）表示。用Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度驟變對花鱸活動和攝食的影響

在階段Ⅰ中，A組從鹽度18驟降至0，魚游動正常，與C組無差異；但鹽度驟變后出現(xiàn)停食現(xiàn)象，到3 d時才開始恢復(fù)攝食。B組從鹽度18驟升至33，魚活動也正常，到6 d時開始恢復(fù)攝食。

在階段Ⅱ中，鹽度驟變首日，A、B組魚活動均表現(xiàn)為經(jīng)常臥底、游動遲緩，3 d起各組魚游動能力逐漸恢復(fù)，6 d起游動狀態(tài)與C組無差異；7 d內(nèi)均未攝食。

2.2 鹽度驟變對花鱸血清代謝酶活力的影響

如圖1所示，在A-Ⅰ階段中，A組血清中AKP、ACP、GPT和GOT活力均出現(xiàn)上升。其中，AKP僅在0.5 d與C組間差異顯著（P＜0.05）；ACP、GPT活力在0.5～3 d時與C組間差異顯著（P＜0.05）；GOT活力在3 d時與C組間差異顯著（P＜0.05）；隨后，各代謝酶活力下降至與C組間無顯著性差異（P＞0.05）。在A-Ⅱ階段，鹽度從0驟變至33，A組各代謝酶活力均又出現(xiàn)上升。其中，AKP在處理后0.5 d和3 d時與C組間差異顯著（P＜0.05）；ACP在0.5 d時與C組間差異顯著（P＜0.05）；GPT和GOT在0.5～1 d時與C組間差異顯著（P＜0.05）；隨后各指標下降至與C組間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 鹽度驟變對花鱸血清代謝酶活力的影響Fig.1 Impact of abrupt salinity changes on activity of metabolic enzymes in serum of Lateolabrax maculatus

B-Ⅰ階段，B組AKP和ACP活力與C組間無顯著性差異（P＞0.05）。而GPT和GOT活力分別在處理后0.5 d和0.5～3 d時出現(xiàn)下降，并與C組間有顯著性差異（P＜0.05）；隨脅迫時間延長，GPT在1 d時恢復(fù)至與C組間無顯著性差異（P＞0.05），GOT則在7 d時恢復(fù)到與C組間無顯著性差異（P＞0.05）。在隨后B-Ⅱ（鹽度33驟降至0）階段，B組AKP 0.5 d時先顯著上升（P＜0.05），隨后開始下降，至7 d時降至顯著低于C組（P＜0.05）；ACP活力在0.5～3 d時均與C組間有顯著性差異（P＜0.05）；至7 d時恢復(fù)至無顯著性差異（P＞0.05）。GPT活力在1 d時與C組呈顯著性差異（P＜0.05），隨后下降至無顯著性差異（P＞0.05）；GOT活力出現(xiàn)先升后降的變化，0.5 d和1 d時顯著高于C組（P＜0.05），7 d時又下降至顯著低于C組（P＜0.05）。

2.3 鹽度驟變對花鱸血清皮質(zhì)醇含量的影響

如圖2所示，在A-Ⅰ階段中，A組血清中COR含量出現(xiàn)上升，在0.5～3 d時均顯著高于C組（P＜0.05）；7 d時下降至與C組間無顯著性差異（P＞0.05）。A-Ⅱ階段，A組COR含量在0.5～1 d時顯著高于C組（P＜0.05）；隨后3～7 d時降至與C組間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 鹽度驟變對花鱸血清皮質(zhì)醇含量的影響Fig.2 Impact of abrupt salinity changes on cortisol content in serum of Lateolabrax maculatus

在B-Ⅰ階段中，實驗3 d內(nèi)B組COR含量與C組間無顯著性差異（P＞0.05），7 d時B組與C組間有顯著性差異（P＜0.05）。B-Ⅱ階段中，B組COR含量先升高后降低，在1 d時與C組有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 鹽度驟變對花鱸肝臟代謝酶活力的影響

如圖3所示，A-Ⅰ階段中，A組花鱸肝臟中AKP活力先升后降，在0.5～1 d時與C組間有顯著性差異（P＜0.05）；ACP活力先降后升，在0.5 d時與C組有顯著性差異（P＜0.05）；GPT活力呈先升后降的變化，在0.5～1 d時顯著高于C組（P＜0.05），而3～7 d時又顯著低于C組（P＜0.05）；GOT活力持續(xù)高于C組，但僅0.5 d時有顯著性差異（P＜0.05）。在A-Ⅱ階段中，A組AKP活力持續(xù)升高，且在1～7 d時均與C組有顯著性差異（P＜0.05）；ACP活力在7 d時升高至與C組有顯著性差異（P＜0.05）；GPT活力整個階段與C組無顯著性差異（P＞0.05）；GOT活力在A-Ⅱ階段均與C組間有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 鹽度驟變對花鱸肝臟代謝酶活力的影響Fig.3 Impact of abrupt salinity changes on activity of metabolic enzymes in liver of Lateolabrax maculatus

B-Ⅰ階段中，B組AKP活力與C組無顯著性差異（P＞0.05）；ACP活力隨時間延長呈波動變化，在1、7 d時與C組間有顯著性差異（P＜0.05）。GPT活力在0.5～1 d時與C組有顯著性差異（P＜0.05），在3 d時恢復(fù)至與C組間無顯著性差異（P＞0.05），在7 d時下降至顯著低于C組（P＜0.05）；GOT活力持續(xù)上升，0.5～7 d均與C組間有顯著性差異（P＜0.05）。在B-Ⅱ階段中，B組AKP活力在3 d時與C組有顯著性差異（P＜0.05）；除了GPT在0.5 d時顯著低于C組（P＜0.05），整個階段ACP、GPT和GOT活力與C組差異均不顯著（P＞0.05）。

2.5 鹽度驟變對花鱸肝臟抗氧化酶活力的影響

如圖4所示，A-Ⅰ階段中，A組花鱸肝臟中SOD活力在0.5～1 d時升高，與C組之間呈顯著性差異（P＜0.05），在3～7 d下降至與C組無顯著性差異（P＞0.05）；GSH-Px活力隨時間延長出現(xiàn)波動，僅3 d時顯著高于C組（P＜0.05）；CAT活力也呈波動變化，但與C組無顯著性差異（P＞0.05）；在A-Ⅱ階段中，A組SOD活力與C組間無顯著性差異（P＞0.05）；GSH-Px和CAT活力均在7 d時升高，與C組間有顯著性差異（P＜0.05）。

圖4 鹽度驟變對花鱸肝臟抗氧化酶活力的影響Fig.4 Impact of abrupt salinity changes on activity of antioxidant enzymes in liver of Lateolabrax maculatus

B-Ⅰ階段中，SOD活力變化不大，與C組之間無顯著性差異（P＞0.05）；而GSH-Px隨時間延長呈波動上升變化，從0.5 d起即與C組間有顯著性差異（P＜0.05）；CAT活力在1～3 d與C組間有顯著性差異（P＜0.05）。B-Ⅱ階段中，SOD活力隨時間延長呈波動式升高變化，0.5、3、7 d時與C組有顯著性差異（P＜0.05）；GSH-Px活力則呈下降變化，在處理1 d后即下降至C組水平（P＞0.05）；CAT活力先降后升，僅處理后1 d與C組間有顯著性差異（P＜0.05），其他時間均與C組間無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 鹽度驟變對花鱸活動和攝食的影響

已有的研究和實際養(yǎng)殖生產(chǎn)均已證實，花鱸對鹽度的適應(yīng)范圍跨度很大。杜濤等［17］認為，鹽度16～17是花鱸的最適生長鹽度；劉陽等［21］認為，低鹽度環(huán)境更有利于花鱸的生長；溫久福等［25］發(fā)現(xiàn)，5個鹽度梯度下（0、10、15、20和30），僅鹽度30出現(xiàn)死亡個例。本實驗研究了鹽度驟變對花鱸活動和攝食的影響，雖然鹽度驟變未造成花鱸死亡，但對其攝食和活動狀態(tài)仍產(chǎn)生了一定影響。鹽度從18驟變到0或33會造成花鱸的停食，而且低鹽向高鹽驟變比高鹽向低鹽驟變對魚活動和攝食的影響更大。從鹽度0驟變到33或從鹽度33驟變到0，不僅造成了停食，而且使其活動狀態(tài)也發(fā)生了變化，但經(jīng)過7 d的適應(yīng)，能恢復(fù)至正常的活動狀態(tài)。結(jié)果表明，在本實驗條件下，花鱸對鹽度大幅度驟變具有一定的耐受性和適應(yīng)性；相對鹽度驟升，本實驗規(guī)格的花鱸對鹽度驟降具有更好的適應(yīng)性。

3.2 代謝酶活力對鹽度驟變的響應(yīng)

魚類在鹽度脅迫下，一般通過加快新陳代謝來為滲透調(diào)節(jié)提供能量。此時機體內(nèi)大量營養(yǎng)物質(zhì)被調(diào)動，多種氨基酸參與其中［26］。有研究證明，體內(nèi)游離氨基酸如谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸和牛磺酸的含量會因鹽度脅迫而升高［7］。而機體部分的新陳代謝活動是由物質(zhì)的磷酸化和去磷酸化來進行調(diào)節(jié)，這些過程主要依靠不同的磷酸酶催化完成［6］。已有研究顯示，海水魚類在鹽度脅迫過程中，肝臟AKP與ACP活力會隨著鹽度的降低顯著升高或者先降低再升高［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，血清中磷酸酶比肝臟中的磷酸酶對鹽度驟變的反應(yīng)更靈敏；花鱸AKP對鹽度驟變的響應(yīng)特征與其他學者研究結(jié)果相似［7，27］；AKP與ACP相比，對鹽度驟變更敏感，表明其在磷酸化過程中具有更重要的作用。

一般認為，轉(zhuǎn)氨酶主要存在肝臟中，而血清中的轉(zhuǎn)氨酶活力較低。通過檢測血清或肝臟中轉(zhuǎn)氨酶活力，可以判斷機體的應(yīng)激程度、評價其攝食水平和生長發(fā)育［28］。本實驗中，血清轉(zhuǎn)氨酶活力為1.18～9.30 U·L－1，而肝臟轉(zhuǎn)氨酶活力則是4.25～20.40 U·gprot－1，若忽略血清的比重，肝臟中的酶活力是血清中的千倍以上。王濤等［29］發(fā)現(xiàn)大黃魚（Pseudosciaenacrocea）在鹽度突降后血清中GPT和GOT活力上升，本研究結(jié)果與其相似。本研究還表明，鹽度不論驟升還是驟降，均對花鱸形成了脅迫，使其發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，導致轉(zhuǎn)氨酶活力上升。當魚體適應(yīng)了環(huán)境變化后，轉(zhuǎn)氨酶活力下降。

3.3 皮質(zhì)醇含量對鹽度驟變的響應(yīng)

處于應(yīng)激狀態(tài)下的魚類，通過下丘腦—垂體—腎間組織產(chǎn)生皮質(zhì)醇等類固醇，并釋放到血液中，體內(nèi)的COR含量在數(shù)小時內(nèi)會急劇升高［30］。COR通過對糖代謝的調(diào)控等形式來提供抵御環(huán)境脅迫所需的能量。但COR含量過高或長期維持在較高的水平，會對魚體造成負面影響［31］。本研究顯示，鹽度從18驟降到0時，0.5 d后皮質(zhì)醇即有顯著變化；而鹽度從18驟升到33時，7 d后皮質(zhì)醇才有顯著性變化?？梢姡|對鹽度驟降可以作出更快的響應(yīng)。

3.4 抗氧化酶活力對鹽度驟變的響應(yīng)

有關(guān)環(huán)境條件改變會引起生物體內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生的現(xiàn)象已有報道［32－33］，機體為抵御環(huán)境脅迫會作出免疫反應(yīng)，產(chǎn)生過量的自由基，為抵御活性氧自由基對細胞的損傷，機體會通過抗氧化酶系統(tǒng)來清除體內(nèi)自由基和活性氧物質(zhì)［34］。本實驗中，SOD活力在鹽度驟降過程中出現(xiàn)升高，這與以往研究得出的結(jié)果相似［33，35］；而GSH-Px和CAT活力在鹽度驟降過程中與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。鹽度驟升條件下，SOD活力未出現(xiàn)上升，而GSH-Px和CAT活力均出現(xiàn)上升。本實驗結(jié)果表明，SOD主要在鹽度驟降時發(fā)揮作用，而GSH-Px和CAT則在鹽度驟升時發(fā)揮作用。

一般認為，在清除活性氧的過程中，SOD最早發(fā)揮作用，其通過歧化作用來分解超氧陰離子自由基·O－2，并產(chǎn)生H2O2［4］。再 由CAT和GSH-Px將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2［36］。本實驗中，鹽度從18驟降至0時，SOD活力在0.5 d時顯著升高，GSH-Px則在3 d時達到峰值；鹽度從33驟降至0時，SOD活力持續(xù)升高，GSH-Px和CAT活力則在實驗過程后期中出現(xiàn)上升，但與對照組相比無顯著性差異。這種變化規(guī)律可能印證了SOD在活性氧清除反應(yīng)中處于核心的地位［37］。SOD、GSH-Px和CAT在抗氧化系統(tǒng)中相互協(xié)調(diào)，發(fā)揮著清除自由基的功能［35］。

4 小結(jié)

花鱸在本實驗鹽度大幅度驟變條件下，體內(nèi)代謝酶和抗氧化酶活力以及皮質(zhì)醇含量都出現(xiàn)變化，大部分條件下均呈現(xiàn)隨時間延長先升高后降低的趨勢，表明花鱸在鹽度驟變時產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)。而后可在3～7 d內(nèi)獲得對驟變鹽度的適應(yīng)，說明花鱸對鹽度變化具有良好的耐受性和適應(yīng)性。本實驗條件下，從代謝酶、抗氧化酶活力和皮質(zhì)醇含量等變化特征來看，花鱸對鹽度驟降比鹽度驟升有更強適應(yīng)能力。