不同養(yǎng)殖密度條件下大黃魚的生理響應(yīng)及應(yīng)激敏感指標的篩選

虞嘉玥，王 杰，孫 鵬，唐保軍

（1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090）

在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，養(yǎng)殖人員常采取提高養(yǎng)殖品種養(yǎng)殖密度的方式來獲得更高的經(jīng)濟效益。盡管高密度養(yǎng)殖可以提高水體利用率和單位面積的養(yǎng)殖產(chǎn)量，但同時也存在因養(yǎng)殖密度過高而引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)的風險。養(yǎng)殖密度與魚類的成長和健康狀況等顯著相關(guān)，由高密度引起的應(yīng)激反應(yīng)可能增加魚體的能量消耗，降低機體的免疫能力，增加魚類疾病發(fā)生的可能性，并導致養(yǎng)殖群體生長率和存活率的降低［1－3］。近年來，國內(nèi)外學者針對海水魚類密度應(yīng)激開展了多項研究，涉及魚類的生長、營養(yǎng)、代謝以及免疫調(diào)節(jié)等多個方面。例如，高密度環(huán)境可導致點帶石斑魚（Epinephelusmalabaricus）皮質(zhì)醇和血糖含量升高，且過高或過低的養(yǎng)殖密度均會對其生長和代謝造成負面影響［1］；對大菱鲆（Scophthalmus maximus）的研究發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖會降低其機體的免疫能力，而低密度環(huán)境則有助于提升其免疫力［4］；黃姑魚（Nibeaalbiflora）的餌料系數(shù)與養(yǎng)殖密度呈顯著的負相關(guān)性，而魚體血清中溶菌酶（lysozyme）活力隨養(yǎng)殖密度的增高而降低，故高密度養(yǎng)殖會對黃姑魚的代謝和非特異性免疫造成負面影響［2］；此外，高密度養(yǎng)殖還會降低塞內(nèi)加爾鰨（Soleasenegalensis）體內(nèi)熱激蛋白70（HSP70）基因、胰島素樣生長因子1（IGF-1）基因、溶菌酶以及抗菌肽（HAMP1）基因等多種基因的表達量，從而在應(yīng)激適應(yīng)、生長調(diào)節(jié)和非特異性免疫等方面影響魚體［3］?？梢?，研究魚類在不同密度環(huán)境下的生理變化，闡明魚體密度應(yīng)激的適應(yīng)性調(diào)節(jié)規(guī)律，不僅有助于在生產(chǎn)實踐中采用適當?shù)酿B(yǎng)殖密度以提高養(yǎng)殖效益，還有助于魚類密度應(yīng)激監(jiān)測指標的篩選。

大黃魚（Larimichthyscrocea）屬于近海暖溫、集群洄游性魚類，為我國東南沿海的重要海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類。目前，其人工繁育與養(yǎng)殖技術(shù)已趨于成熟，實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖，養(yǎng)殖產(chǎn)量也居于我國海水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量的前列。鑒于大黃魚在我國海洋漁業(yè)中的重要性，近年來科研人員在諸如大黃魚生理學等方面已經(jīng)開展了許多研究［5－8］，然而，目前對于大黃魚密度應(yīng)激適應(yīng)機制的研究尚未見報道。本研究分析了不同養(yǎng)殖密度下大黃魚體內(nèi)生理指標的變化規(guī)律和重要基因的分子表達特征，探討了應(yīng)激狀態(tài)下魚體的適應(yīng)性調(diào)節(jié)過程，以期為大黃魚密度應(yīng)激適應(yīng)機制研究提供參考，為大黃魚工廠化健康養(yǎng)殖生產(chǎn)和管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚為福建省寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司人工培育的大黃魚，平均體質(zhì)量為（89.06±11.70）g。實驗前于室內(nèi)8 t的水泥池中暫養(yǎng)2周，所用海水經(jīng)過砂濾處理，水溫為（26.5±0.5）℃，鹽度26.0±0.5；使用氣泵進行連續(xù)充氣，每天分別在上午（08∶00）和下午（13∶00）換水1次，換水量為總水體的3／4，每日上午（09∶00）和下午（14∶00）各投喂顆粒飼料1次。

1.2 實驗設(shè)計

處理過程在12個0.5 t的PVE缸中進行，實驗前根據(jù)網(wǎng)箱正常養(yǎng)殖密度設(shè)置300%、200%、100%和50%共4個密度梯度，每個密度梯度設(shè)3個平行，相應(yīng)地將12個缸平均分為4組（A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D3，其中C組為標準養(yǎng)殖密度對照組），并將暫養(yǎng)的大黃魚轉(zhuǎn)入。每個平行大黃魚數(shù)目分別為390、260、130、65尾。處理和取樣過程中記錄各組大黃魚的行為狀況和死亡率，并根據(jù)存活情況和密度設(shè)置調(diào)換缸體和水位，以保證整個實驗期間各組大黃魚密度始終分別維持在34.2 kg·m－3（A組）、22.8 kg·m－3（B組）、11.4 kg·m－3（C組）和5.7 kg·m－3（D組）。

1.3 樣品采集

分別在處理的0、6、12、24、48、72、96、120 h對實驗用魚進行取樣，取樣時每次從各缸中隨機選取6尾大黃魚個體，迅速用MS-222麻醉后進行尾靜脈取血和解剖。無菌采集肝臟組織，一部分直接保存于液氮中，其余部分準確稱重后經(jīng)勻漿和離心（3 000 r·min－1，10 min）取得上清液用于酶活力等指標的測定；血液樣品放置在4℃靜置6 h后進行離心（4 000 r·min－1，10 min），收集上層血清用于皮質(zhì)醇、血糖等指標測定；每個樣品重復測定3次。皮質(zhì)醇、生長激素（growth hormone，GH）和胰島素樣生長因子1指標采用ELISA方法測定，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血糖指標采用比色法測定，過氧化氫酶（catalase，CAT）、溶菌酶和乳酸等指標采用分光光度法測定，測定所用試劑盒購于南京建成生物工程研究所，具體測定方法參照說明書進行。

1.4 基因表達分析

取出液氮保存的肝臟組織樣品，以C組0 h樣品作為對照，對最高密度組（A組）樣品進行基因表達分析。采用Trizol試劑（上海生工）提取大黃魚總RNA，經(jīng)完整性和純度檢測后反轉(zhuǎn)成cDNA作為模板進行基因表達分析，所有操作均按照試劑盒說明書進行。本次基因表達分析選用3個基因，分別為葡萄糖-6-磷酸酶（G6pase）基因、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）基因和C型溶菌酶（C-lysozyme）基因，涉及應(yīng)激調(diào)控相關(guān)的能量代謝、生長調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)等生物進程，并以β-actin作為內(nèi)參。實驗所涉及引物序列如表1所示，其中G6pase基因引物序列參考實驗室已有大黃魚基因組序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計；其余兩個基因IGF-1和C-lysozyme采用已有引物進行合成和擴增分析［9－10］。qPCR采用10μL反應(yīng)體系，包含2×SYBR Premix ExTaq（TaKaRa）5 μL、正反向引物各0.5μL、cDNA模板0.5μL，并以滅菌水補足至10μL。反應(yīng)條件為：95℃預變性2 min；95℃15 s，58℃30 s，72℃30 s，共計40個循環(huán)。

表1 定量PCR所用引物Tab.1 Primers used for qPCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)分析

熒光定量實驗結(jié)果從儀器讀取，用2－△△CT法分析計算目的基因的相對表達量，用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（x±SE）的形式表示；利用SPSS 25.0軟件對不同密度條件下各組樣品生理指標數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA），并對各組的差異數(shù)據(jù)做LSD多重比較，P＜0.05表明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同養(yǎng)殖密度對大黃魚死亡率和皮質(zhì)醇變化的影響

實驗期間C組和D組大黃魚未出現(xiàn)死亡個體，A組和B組的死亡率變化趨勢如圖1所示。隨著養(yǎng)殖密度的增高，死亡率也有所增加，而在處理6 h和72 h時，兩組魚死亡率出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。B組個體在處理6 h時開始出現(xiàn)死亡個體，最高死亡率出現(xiàn)在處理24 h時，之后便逐漸降低；而A組魚在處理6 h時即出現(xiàn)最高死亡率，高死亡率出現(xiàn)的時間明顯提前，在穩(wěn)定一段時間后，到應(yīng)激處理48 h至72 h時再次出現(xiàn)死亡高峰。

圖1 密度脅迫下A組和B組大黃魚的死亡率變化趨勢Fig.1 Changes of mortality in Larimichthys crocea under density stress（group A and B）

如圖2所示，A組大黃魚血清皮質(zhì)醇含量快速升高，在處理6 h時含量顯著高于0 h（P＜0.05），在處理12 h時達到最大值，且在6 h和12 h時均顯著高于C組（P＜0.05）。B組大黃魚皮質(zhì)醇先快速升高并在處理12 h時顯著高于C組；隨后，皮質(zhì)醇含量逐漸降低，并最終與C組無顯著差異（P＞0.05）。在整個實驗期間，C、D兩組大黃魚皮質(zhì)醇含量均無顯著性變化（P＞0.05）。

圖2 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚的皮質(zhì)醇含量變化Fig.2 Changes of cortisol concentration in L.crocea under different stocking densities

2.2 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚血糖和乳酸等能量代謝指標變化

如圖3-a所示，A組個體中血糖含量在處理12 h時顯著高于C組（P＜0.05），其峰值出現(xiàn)在處理72 h時；隨后，在處理96 h血糖含量開始降低，并最終與C組無顯著性差異（P＞0.05）。B組大黃魚血糖含量也與A組呈現(xiàn)相似的變化趨勢，但峰值出現(xiàn)在處理48 h時。C組和D組大黃魚血糖含量整個實驗期間無顯著性變化（P＞0.05）。

A組大黃魚血清中乳酸含量處理后快速升高（圖3-b），處理6 h時，血清中乳酸含量顯著高于C組（P＜0.05），在處理12 h時達到最高值。在整個處理過程中，B組和C組乳酸含量無顯著性變化（P＞0.05）。D組乳酸含量在處理6 h時顯著降低（P＜0.05），之后又逐漸恢復到接近C組水平。

圖3 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚的血糖和乳酸含量變化Fig.3 Changes of glucose and lactic acid concentration in L.crocea under different stocking densities

2.3 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚抗氧化能力變化

在處理24 h時，A組魚肝臟中SOD活力快速升高并顯著高于C組（P＜0.05）（圖4-a）；隨后，其活力逐漸降低并恢復至接近C組的水平。B組SOD活力也呈現(xiàn)與A組類似的趨勢，但最大值出現(xiàn)在處理48 h時。C、D組SOD活力在整個處理過程中無顯著性變化（P＞0.05）。

圖4 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力變化Fig.4 Changes of SOD and CAT activity in L.crocea under different stocking densities

A、B組大黃魚CAT活力在處理120 h時均快速升高并顯著高于C組（P＜0.05）。C、D兩組CAT活力在處理過程中未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）。

2.4 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚生長調(diào)控指標變化

如圖5所示，各組大黃魚血清中生長激素含量在整個處理過程中始終未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）。C、D兩組血清胰島素樣生長因子-1含量整個處理過程無顯著性變化（P＞0.05），但A、B兩組血清胰島素樣生長因子-1含量顯著升高。A組血清胰島素樣生長因子-1在處理24 h至48 h階段顯著高于C組（P＜0.05）；B組血清胰島素樣生長因子-1含量在處理24 h及72～96 h階段顯著高于C組（P＜0.05）；隨后，兩組個體的血清胰島素樣生長因子-1含量又快速降低至與C組無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚生長激素和胰島素樣生長因子-1含量變化Fig.5 Changes of GH and IGF-1 concentration in L.crocea under different stocking densities

2.5 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚溶菌酶活力變化

C、D組大黃魚血清中溶菌酶活力（圖6）在整個處理階段無顯著性變化（P＞0.05）。A、B組溶菌酶活力在處理6 h時顯著降低（P＜0.05），隨后回升一段時間后又再次降低，并在處理120 h時顯著低于C組（P＜0.05）。

圖6 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚溶菌酶活力變化Fig.6 Changes of lysozyme activity in L.crocea under different stocking densities

2.6 高養(yǎng)殖密度條件下大黃魚代謝、生長和免疫相關(guān)基因表達規(guī)律

高密度應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚基因表達變化趨勢如圖7所示。其中，G6Pase基因表達在處理6 h時快速升高，直至處理96 h時表達量一直顯著高于0 h（P＜0.05）；隨后，表達量降低并在處理120 h時恢復至與0 h無顯著性差異（P＞0.05）。IGF-1基因表達量在處理24 h時達到最高值，隨后開始逐漸降低，但直至處理結(jié)束時仍一直顯著高于處理前水平（P＜0.05）。C-lysozyme基因表達量在處理24 h時也迅速達到最高值（P＜0.05），之后逐漸降低，并在處理120 h時恢復到0 h水平（P＞0.05）。

圖7 高密度養(yǎng)殖狀態(tài)下大黃魚基因表達變化Fig.7 Changes of gene expression of L.crocea under high stocking density

3 討論

3.1 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚的神經(jīng)內(nèi)分泌和代謝調(diào)節(jié)

魚類在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中經(jīng)常會處于各種外界因素脅迫中，養(yǎng)殖密度脅迫是其中之一。外界環(huán)境變化可引發(fā)魚體的應(yīng)激反應(yīng)，進而影響其生長、免疫和繁殖等功能［11－16］。魚體受到外界刺激時會產(chǎn)生皮質(zhì)醇并釋放到血液中，皮質(zhì)醇是反映魚類應(yīng)激狀態(tài)的重要指標，在魚類遭受多種外界環(huán)境刺激后其含量都會快速升高。例如，銀鯧（Pampusargenteus）［17］和大黃魚［18］在運輸脅迫后血清中皮質(zhì)醇含量迅速上升；大西洋鮭（Salmo salar）［19］經(jīng)操作脅迫處理后，皮質(zhì)醇含量快速升高；同樣，當點帶石斑魚［1］和塞內(nèi)加爾鰨［3］養(yǎng)殖密度增高時，皮質(zhì)醇含量也會顯著增加。本研究中，在高密度養(yǎng)殖條件下，大黃魚血清皮質(zhì)醇含量也有類似的變化，這既是大黃魚應(yīng)對高密度脅迫的適應(yīng)性調(diào)節(jié)，也反映出皮質(zhì)醇作為大黃魚密度應(yīng)激反應(yīng)指示指標的靈敏性。

SALAS-LEITON等［3］發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖密度越高，越容易產(chǎn)生擁擠脅迫作用，從而導致魚類能量需求的增強和能量儲備的調(diào)動。作為魚類體內(nèi)各種生命活動所需能量的直接來源，血糖含量變化直接反映著魚體的能量調(diào)動進程。在高密度條件下，大黃魚血糖含量顯著增加并一直持續(xù)到處理后期；同時，肝臟中葡萄糖-6-磷酸酶基因表達在處理6 h時也顯著升高，直至處理120 h時才恢復到處理前水平，這與血糖指標的變化趨勢基本一致。葡萄糖-6-磷酸酶是一種水解磷酸化合物的磷酸酶，在肝臟中通過水解葡萄糖-6-磷酸釋放葡萄糖進入血液，以補充維持血糖平衡。高密度應(yīng)激狀態(tài)下，大黃魚的高血糖含量表明適應(yīng)性調(diào)節(jié)過程中的巨大能量需求，為此魚體需要通過增加能量代謝、加速糖原分解來為機體供能。A組大黃魚血清中乳酸含量顯著升高，相似的情況還見于高密度狀態(tài)下的點帶石斑魚［1］；在運輸脅迫過程中，大黃魚血清乳酸含量也有類似變化［18］。

在整個處理過程中，大黃魚血清中生長激素含量未發(fā)生明顯變化，但A、B組個體中胰島素樣生長因子-1含量均顯著升高。同樣，高密度應(yīng)激狀態(tài)下大黃魚肝臟IGF-1基因表達也出現(xiàn)相似的變化趨勢，表達量在處理24 h時開始顯著增加。魚類的胰島素樣生長因子-1是一種由70個氨基酸組成的多肽，具有刺激生長和分化的作用；同時，在滲透壓調(diào)節(jié)、繁殖、骨質(zhì)平衡、免疫應(yīng)答和新陳代謝等方面也發(fā)揮著重要的生理功能［20－22］。胰島素樣生長因子-1可顯著提高不同養(yǎng)殖狀態(tài)下魚體的乳酸脫氫酶（一種糖酵解酶），催化乳酸氧化為丙酸，將氫轉(zhuǎn)移給輔酶I（NAD）成為還原性輔酶I（NADH）［22］。因此，推測胰島素樣生長因子-1含量較高可能與大黃魚應(yīng)激狀態(tài)下體內(nèi)乳酸變化和能量代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。

3.2 不同養(yǎng)殖密度下大黃魚的抗氧化與免疫調(diào)節(jié)

應(yīng)激過程中自由基會在魚體內(nèi)迅速積累，當其超過機體的清除能力時會對魚體造成氧化損傷［20］，SOD和CAT在清除自由基方面發(fā)揮著重要作用。A、B組大黃魚肝臟SOD活力顯著升高，意味著魚體內(nèi)自由基的大量積累。其中，B組大黃魚肝臟SOD活力變化有一定的滯后性，推測與該組魚體受脅迫程度和體內(nèi)自由基的積累速度有關(guān)。與SOD活力變化情況不同，CAT活力是在處理后期開始升高。CAT主要負責催化SOD清除過程中產(chǎn)生的H2O2，故其調(diào)節(jié)過程可能遲于SOD。大黃魚最終的高CAT活力狀態(tài)表明，其體內(nèi)自由基含量仍處于較高的水平，如果長期處于該狀態(tài)將造成體內(nèi)的細胞損傷，進而影響機體的正常生理機能。

溶菌酶在魚類免疫防御方面發(fā)揮著重要作用。研究顯示，大西洋鮭、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［23］、黃姑魚［2］、塞內(nèi)加爾鰨［24］和半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）［25］等多種魚類體內(nèi)的溶菌酶活力均會在急性脅迫情況下發(fā)生顯著變化。例如，在急性操作脅迫下，塞內(nèi)加爾鰨溶菌酶活力呈現(xiàn)降低的趨勢［24］，而在渾濁水體中半滑舌鰨肝臟溶菌酶活力也隨懸浮物濃度升高和處理時間延長而顯著升高［25］。可見，溶菌酶活力的變化趨勢和響應(yīng)時間與外界脅迫因素的種類和強度有關(guān)；同時，也有可能因魚種而異。在本研究中，A、B組大黃魚血清溶菌酶活力顯著低于其他密度組，這與密度脅迫狀態(tài)下黃姑魚的情況相似［2］，推測密度脅迫對大黃魚溶菌酶活力具有抑制作用。然而，本研究結(jié)果顯示，溶菌酶的基因表達趨勢與溶菌酶活力變化趨勢存在差異。與溶菌酶活力下降不同，在處理24 h時溶菌酶基因表達量快速升高。考慮到大黃魚體內(nèi)存在著兩種溶菌酶（C-type和G-type）［10］，而試劑盒測定的是總?cè)芫傅乃饽芰?，故酶活力變化可能與基因表達量變化存在差異。同時，這也可能與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及機體所處的生理狀態(tài)有關(guān)。

3.3 大黃魚密度應(yīng)激監(jiān)測指示標記的篩選

目前，魚類的應(yīng)激信息常通過直接人為觀察獲得，因受觀察者的主觀條件影響而不容易及時發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)的問題，故選擇適當?shù)纳镄?yīng)標記（biomarker）進行魚體健康監(jiān)測是十分必要的。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在驚擾應(yīng)激狀態(tài)下，大黃魚部分生理指標會出現(xiàn)變化，而其中變化較為顯著的有血糖、乳酸、溶菌酶以及SOD和CAT等，表明這些指標對驚擾應(yīng)激具有較好的指示作用。然而，本研究與之相比，其中部分指標的變化規(guī)律有所不同；另有部分指標變化規(guī)律相似，但到達峰值的時間卻存在差異［26］。可見，生物標記物會因物種和脅迫因素不同而存在差異，故特定物種應(yīng)激敏感生物標記物的篩選也就變得十分重要。本研究通過分析養(yǎng)殖密度對大黃魚的生理影響，探討了大黃魚在密度應(yīng)激狀態(tài)下的適應(yīng)規(guī)律。研究表明，高密度應(yīng)激可導致大黃魚體內(nèi)多種生理生化指標發(fā)生變化，其中皮質(zhì)醇、血糖、SOD和CAT等的變化更為顯著，顯示了這些指標作為應(yīng)激生物指示劑的潛力［27］。

在應(yīng)激反應(yīng)初期，大黃魚可通過自身調(diào)節(jié)響應(yīng)外界刺激，魚體也努力地適應(yīng)新環(huán)境。然而，若長期處于應(yīng)激狀態(tài)，則會影響其能量供給和細胞健康，最終導致生長和抗病等方面機能的降低。因此，根據(jù)大黃魚應(yīng)激指標變化對魚體的狀態(tài)進行監(jiān)測、跟蹤并采取必要的應(yīng)對措施，將有助于改善養(yǎng)殖群體的生理狀態(tài)，進而促進魚體的健康成長。同時，值得注意的是，不同生理指標的變化趨勢存在差異，故其應(yīng)用于應(yīng)激監(jiān)測時還需結(jié)合具體情況進行分析。例如，研究顯示，密度應(yīng)激大黃魚的皮質(zhì)醇和血糖響應(yīng)較為迅速，在高密度應(yīng)激初期就顯著升高，因此適合衡量急性脅迫情況下的魚體生理狀態(tài)；而CAT在應(yīng)激初期并無顯著變化，但在持續(xù)應(yīng)激72 h至120 h時呈現(xiàn)顯著升高的趨勢，故適合用于衡量持續(xù)較長時間的密度應(yīng)激或應(yīng)激效應(yīng)積累過程中的魚體生理狀態(tài)。