基于線粒體基因cox1的中國近海褐斑鲬遺傳多樣性研究

黃志基，章 群，楊喜書，羅 純，張玉寧

（暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣州 510632）

褐斑鲬（Platycephalussp.1）隸屬于鲉形目（Scorpaeniformes）鲬科（Platycephalidae）鲬屬，拉丁學(xué)名至今未定，故而采用Platycephalussp.1表示。褐斑鲬廣泛分布于西北太平洋淺海泥沙質(zhì)海底中［1－3］，2齡達(dá)性成熟［4］，于5—6月產(chǎn)浮性卵，受精卵在海水上層經(jīng)35 d發(fā)育成幼魚［5－6］，之后潛入海底伏擊捕食，年齡最高可達(dá)6齡［4］，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用。褐斑鲬是我國近海拖網(wǎng)漁業(yè)的重要漁獲種類，在日本、韓國、東南亞等地則被視為高級食材，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究表明，近年來由于過度捕撈、環(huán)境污染等因素影響，中國褐斑鲬出現(xiàn)了低齡化、生物量明顯下降的現(xiàn)象［7］，亟待加強(qiáng)種質(zhì)資源保護(hù)。了解物種遺傳多樣性狀況是種質(zhì)資源保護(hù)的基礎(chǔ)，因此對其進(jìn)行遺傳多樣性研究具有重要的科學(xué)意義。

20世紀(jì)60年代，KAMEI和ISHIYAMAS［8］首次報(bào)道了褐斑鲬，之后其他學(xué)者通過分子方法驗(yàn)證了物種有效性［9－10］，2013年QIN等［11］將其中文名定為褐斑鲬［1］。在種群遺傳方面已有秦巖［1］、李玉龍等［12］、CHENG等［13］分別基于線粒體控制區(qū)（D-loop）和Cytb基因標(biāo)記研究了褐斑鲬遺傳多樣性，但研究中部分樣本為小群體或地理群體數(shù)量少，不足以全面反映中國近海褐斑鲬遺傳背景。線粒體基因組為母系遺傳，有效群體數(shù)量僅為核基因的1／4，變異速率是核基因的4～10倍，較小的群體數(shù)量即可表征群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)；同時(shí)，還具有拷貝數(shù)高、雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)、不易降解、易擴(kuò)增等特點(diǎn)，使其成為種群遺傳研究的首選分子標(biāo)記。其中cox1是位于線粒體基因組上的細(xì)胞色素C氧化酶輔酶Ⅰ編碼基因，適中的變異速率使得其能避免堿基替換飽和問題，不僅可作為標(biāo)準(zhǔn)條形碼應(yīng)用于動物物種鑒定，還適用于種群遺傳多樣性的分析。對藍(lán)點(diǎn)馬鮫（Scomberomorus niphonius）［14］、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）［15］、中國鯧（Pampus chinensis）［16］等遺傳多樣性研究也證明，cox1是適合遺傳多樣性分析的有效分子標(biāo)記。本文基于線粒體基因cox1對褐斑鲬進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在更好地了解中國近海褐斑鲬遺傳背景，為其種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用樣品購自近海作業(yè)的漁民處，分別采集于山東濰坊羊口（濰坊群體）、遼寧大連金石灘（大連群體）、江蘇連云港（連云港群體）、江蘇南通呂四（南通群體）、福建福州平潭（福州群體）、廣東揭陽惠來（揭陽群體）、廣西防城港東興（防城港群體）（表1）。樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后取背部肌肉組織樣本保存于95%乙醇溶液中備用。

表1 中國近海褐斑鲬采樣信息Tab.1 Information of Platycephalus sp.1 samples

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用酚氯仿抽提法［17］提取肌肉組織樣本的DNA。采用通用引物對FishF1-FishR1［18］和本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)引物COIF：CTCAGCCATCCTACC TGTGG；COIR：TATTCCAAAGCCCGGGAGAA。PCR總反應(yīng)體系為25μL，包括：10×PCR緩沖液2.5μL，兩端引物各1μL（10μmol·mL－1），dNTP 2μL（200μmol·L－1），TaqDNA聚合酶0.15（5 U·μL－1）；模板DNA 1μL，加超純水至總體積25μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火35 s，72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸7 min。電泳檢測到目的片段后（cox15′端約750 bp），將PCR產(chǎn)物送至廣州華大基因有限公司切膠純化并測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測定序列在BioEdit 7.0.9.0［19］中校對、對齊。由MEGA 10.0.5［20］計(jì)算序列特征數(shù)據(jù)。在DnaSP 6.12.03［21］中計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)信息和各地群體、4個(gè)海域群組及整體的變異位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)量、單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸 多 樣 性（nucleotide diversity，π）。采 用Arlequin 3.5［22］基于K2P-distance計(jì)算遺傳分化系數(shù)Fst，以公式Nm＝（1／Fst-1）／4計(jì)算基因流Nm；采用AMOVA（analysis of molecular variance）分析種群內(nèi)部的層級結(jié)構(gòu)。以TCS［23］構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，分析單倍型地理結(jié)構(gòu)和譜系結(jié)構(gòu)。使用Arlequin中性檢驗(yàn)?zāi)K的Tajima’sD和Fu’sFs計(jì)算出D和Fs值，結(jié)合歧點(diǎn)分布圖（mismatch distribution）、單倍型網(wǎng)絡(luò)圖、Bayesian skyline plot（BSP），綜合判斷種群在歷史上有沒有出現(xiàn)擴(kuò)張現(xiàn)象。根據(jù)擴(kuò)張模型估算出τ值并通過公式計(jì)算種群擴(kuò)張時(shí)間，公式分別為：

式中，τ為擴(kuò)張時(shí)間參數(shù)；u＝μk，μ為cox1基因的變異速率［（1%～3%）·Ma－1］［24］，k表示序列長度（652）；t表示自擴(kuò)張以來所經(jīng)歷的代數(shù)，T值即為最終所求的擴(kuò)張時(shí)間，代時(shí)為該物種的生殖周期（約為1年）［5］。

同時(shí)，在BEAST 1.10.4［25］中設(shè)置參數(shù)為200 000 000 MCMC鏈長、變異速率1%·Ma－1和HBY堿基替換模型，分析繪制BSP（有效采樣量ESS＞200）以模擬有效種群大小的歷史動態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐斑鲬cox1序列特征與遺傳多樣性

在155條652 bpcox1序列中，堿基比例為T：27.3%、C：30.5%、A：23.0%、G：19.2%，A＋T含量（50.3%）稍高于G＋C（49.7%）。無插入和缺失現(xiàn)象，變異位點(diǎn)28個(gè)，其中簡約信息位點(diǎn)5個(gè)；定義28個(gè)單倍型，4個(gè)共享單倍型，24個(gè)獨(dú)立單倍型。整體來看屬于低單倍型多樣性（0.428±0.051）、低核苷酸多樣性（0.001 02±0.000 15）類型。各個(gè)群體變異位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)量、單倍型多樣性和核苷酸多樣性詳見表2。其中，單倍型多樣性數(shù)值分布在0.298～0.864，核苷酸多樣性則是0.000 61～0.003 02。防城港群體遺傳多樣性最高（Hd＝0.864±0.079，π＝0.003 02±0.000 52）；連云港群體單倍型多樣性居次（Hd＝0.489±0.112），福州群體單倍型多樣性最低（Hd＝0.298±0.133）；大連群體核苷酸多樣性居次（π＝0.001 24±0.000 52），南通群體核苷酸多樣性最低（π＝0.000 61±0.000 25）。按4個(gè)海域劃分，群體單倍型多樣性為0.298～0.525、核苷酸多樣性為0.000 65～0.001 46；其中，東海最低，南海最高。南海內(nèi)部揭陽和防城港群體間差異較大。

表2 褐斑鲬群體樣本數(shù)量及遺傳多樣性Tab.2 Sample size and genetic diversity of Platycephalus sp.1 populations

2.2 褐斑鲬種群遺傳結(jié)構(gòu)

群體間分化系數(shù)Fst如表3所示，群體間Fst分布在－0.021 27～0.189 29范圍內(nèi)，防城港與其他地方群體間（Fst：0.088 61～0.189 29）存在顯著至極顯著的中度（0.05＜Fst＜0.15）到高度分化（0.15＜Fst＜0.25），其余群體之間則分化程度低（－0.021 27～0.027 49）?；蛄鱊m顯示，防城港與其余群體之間基因交流較低（Nm＜4），其余群體則形成自由交配的組群（表3）。

表3 褐斑鲬地理群體間遺傳分化系數(shù)Fst與基因流NmTab.3 Genetic differentiation index（Fst）and gene flow（Nm）among Platycephalus sp.1 populations

分子方差分析（AMOVA）表明（表4），4個(gè)海域組群間Fct＝0.038 39，對應(yīng)P＝0.500 49±0.016 56，變異比例為－3.84%，說明海域組群間具有較高的同質(zhì)性，未出現(xiàn)明顯的海域間結(jié)構(gòu)，臺灣海峽、渤海海峽和開放海域-邊緣海域性質(zhì)差異并非褐斑鲬群體遺傳分化的成因；反觀瓊州海峽東西兩側(cè)群體間的Fct＝0.244 12，對應(yīng)P＝0.153 47±0.011 15，變異比例占24.19%，與Fst呈現(xiàn)的結(jié)果相吻合，說明瓊州海峽兩側(cè)群體間的差異雖然較大，但并未達(dá)到遺傳結(jié)構(gòu)的層次。

表4 中國近海褐斑鲬群體結(jié)構(gòu)的分子方差分析Tab.4 AMOVA analysis of Platycephalus sp.1 population structure in coastal waters of China

單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖1）顯示，褐斑鲬單倍型總體呈星狀結(jié)構(gòu)，譜系結(jié)構(gòu)不明顯。主體單倍型為Hap＿1，頻數(shù)117，頻率0.755，廣泛分布于中國近海；Hap＿2、Hap＿6、Hap＿18為共享單倍型，Hap＿2由濰坊群體和福州群體共享，Hap＿6僅在揭陽群體和防城港群體無分布，Hap＿18由防城港群體和福州群體共享；其他單倍型為獨(dú)立單倍型。星狀結(jié)構(gòu)代表褐斑鲬發(fā)生過種群擴(kuò)張事件，即極可能以Hap＿1為祖先單倍型輻射生成其他單倍型。

2.3 褐斑鲬種群歷史動態(tài)

由于瓊州海峽兩側(cè)群體間出現(xiàn)了中到高度遺傳分化，基因交流較弱，因此設(shè)置防城港群體、瓊州海峽東側(cè)群體和中國近海整體3個(gè)組群分別分析種群歷史動態(tài)。中性檢驗(yàn)（Tajima’sD和Fu’sFs） 和基于Spatial擴(kuò)張模型的估算結(jié)果見表5，岐點(diǎn)分布見圖2，BSP種群歷史動態(tài)分析見圖3。

圖2 基于cox1序列的褐斑鲬群體岐點(diǎn)分布圖Fig.2 Distribution of pairwise differences for cox1 sequences within Platycephalus sp.1 populations

圖3 褐斑鲬B(tài)SP種群歷史動態(tài)分析Fig.3 Bayesian skyline plot of Platycephalus sp.1 populations

表5 褐斑鲬群體中性檢驗(yàn)、不對稱分析Tab.5 Neutrality test and mismatch analysis of Platycephalus sp.1 populations

中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)組群均發(fā)生過種群擴(kuò)張。防城港群體岐點(diǎn)分布圖（圖2-A）為明顯單峰，根據(jù)spatial expansion model估計(jì)擴(kuò)張時(shí)間在16.7萬年前～5.6萬年前，屬于晚更新世末次間冰期。瓊州海峽以東群體擴(kuò)張時(shí)間分布在3.3萬年前～1.1萬年前，BSP分析擴(kuò)張時(shí)間約為2.5萬年前，屬于末次冰期中后期。中國褐斑鲬整體擴(kuò)張時(shí)間在3.8萬年前～1.3萬年前，BSP分析擴(kuò)張時(shí)間約為3萬年前，屬于末次冰期中后期。

3 討論

3.1 種群歷史動態(tài)

本研究中，中性檢驗(yàn)結(jié)果為顯著負(fù)值、星狀單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和BSP分析結(jié)果表明，中國褐斑鲬瓊州海峽兩側(cè)群體和中國近海整體歷史上都經(jīng)歷了擴(kuò)張事件。防城港群體擴(kuò)張發(fā)生在末次間冰期，瓊州海峽東側(cè)群體和中國近海整體的擴(kuò)張則發(fā)生在末次冰期中后期。冰期-間冰期回旋導(dǎo)致氣溫、海平面等升降變化，海洋生物種群數(shù)量發(fā)生波動［26］。就褐斑鲬而言，在末次間冰期，殘存于邊緣海的群體隨著末次間冰期海平面上升帶來的生存空間擴(kuò)展而實(shí)現(xiàn)種群擴(kuò)張；末次冰期襲來時(shí)，防城港群體回歸避難所，待到末次冰期后期即冰消期時(shí)，伴隨著海平面上升擴(kuò)張到中國近海海域。一方面，瓊州海峽兩側(cè)群體由于瓊州海峽的阻隔，削弱了海流流動帶來的群體基因交流，逐漸形成明顯的遺傳分化；另一方面，瓊州海峽東側(cè)群體則在洋流作用下趨向同質(zhì)化，而更加廣闊的生存空間仍然推動了種群的快速增長。已有研究也揭示，褐斑鲬種群在末次盛冰期后發(fā)生過擴(kuò)張事件［1，13］。

3.2 褐斑鲬的遺傳多樣性與遺傳分化

本研究中，中國褐斑鲬整體Hd＝0.428、π＝0.001 02，根據(jù)GRANT和BOWEN［27］的海洋魚類遺傳多樣性分類方法，屬于低單倍型多樣性、低核苷酸多樣性類型，其成因可能是種群近期經(jīng)歷了快速擴(kuò)張，短時(shí)間內(nèi)因少量的突變提高了單倍型數(shù)量，但沒有足夠的時(shí)間積累核苷酸突變。對比CHENG等［13］根據(jù)D-loop計(jì)算出的中國近海褐斑鲬Hd＝0.78、π＝0.004 1，可見cox1基因遺傳多樣性較低。由于cox1編碼細(xì)胞色素C氧化酶輔酶Ⅰ參與了氧化磷酸化代謝過程，負(fù)責(zé)體內(nèi)能量的轉(zhuǎn)換，cox1基因序列會受其生物功能帶來的純化選擇作用影響；而線粒體控制區(qū)不編碼蛋白質(zhì)，幾乎不受功能基因選擇壓力的影響。因此二者變異速率不同，遺傳多樣性也有差異。對比具有相似地理分布范圍且同樣使用cox1分析的 近 海 魚 類 藍(lán) 圓 鲹［28］（Hd＝0.63、π＝0.002 3）、藍(lán)點(diǎn)馬鮫［15］（Hd＝0.70、π＝0.002 8）、銀鯧［29］（Hd＝0.62、π＝0.002）可見，褐斑鲬遺傳多樣性相對較小。推測可能的原因是：1）褐斑鲬經(jīng)歷近期種群快速擴(kuò)張，種群建立時(shí)間短，尚未形成豐富的物種基因庫；2）褐斑鲬經(jīng)歷了種群退化。

褐斑鲬受精卵在海水上層漂浮發(fā)育成幼魚后著水底生活前［5－6］，可隨著海流跨越簡單的地理障礙。褐斑鲬在繁殖期（5—6月），會從渤海內(nèi)灣向南隨沿大陸海岸流動的沿岸流南下，此時(shí)黑潮暖流支流和南海暖流匯合北上，兩者于秋季（7—8月）在杭州灣附近匯合，存在于渤海、黃海和東海的由黑潮暖流、黃海暖流、黃海沿岸流、長江口沖淡水、南海暖流等組成的環(huán)流系統(tǒng)可攜帶褐斑鲬受精卵及幼體，以被動擴(kuò)散的方式促進(jìn)各地群體間的基因交流；另外可能還存在黃渤海海域褐斑鲬的生殖洄游行為［5］，這些都是造成瓊州海峽東側(cè)群體同質(zhì)化的可能原因。防城港群體所處的北部灣則由于其半封閉性海洋環(huán)境特征，表層海水在灣內(nèi)形成季風(fēng)環(huán)流，雷州半島-瓊州海峽-海南島結(jié)構(gòu)削弱了洋流流動帶來的北部灣防城港群體和其他海域群體之間的基因交流。因而，中國近海褐斑鲬種群在這種不完全隔離的條件下，出現(xiàn)了瓊州海峽兩側(cè)群體間的遺傳分化。

3.3 褐斑鲬的保護(hù)與開發(fā)

遺傳多樣性是揭示物種適應(yīng)環(huán)境壓力的內(nèi)在指標(biāo)，總體上，高遺傳多樣性代表著對環(huán)境變化的適應(yīng)能力較高，而低遺傳多樣性則可能預(yù)示著種群有衰退甚至滅絕的風(fēng)險(xiǎn)［30］。種群遺傳結(jié)構(gòu)也是種質(zhì)資源管理、保護(hù)和開發(fā)的重要依據(jù)，明確種群遺傳結(jié)構(gòu)有利于設(shè)立管理單元、合理設(shè)置保護(hù)策略和開發(fā)方式。由于中國近海褐斑鲬北部灣防城港群體和瓊州海峽以東群體間出現(xiàn)了顯著至極顯著的中度至高度遺傳分化，應(yīng)分作2個(gè)管理單元，以便采取更具針對性的種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用措施。北部灣防城港群體遺傳多樣性明顯高于其他地方群體，應(yīng)優(yōu)先保護(hù)以便利用；瓊州海峽東側(cè)群組中，大連群體核苷酸多樣性較高，建議將其設(shè)置為另一個(gè)重點(diǎn)保護(hù)群體；而南通群體核苷酸多樣性最低，應(yīng)采取有效措施，避免遺傳多樣性的進(jìn)一步下降。本研究結(jié)果為制定和實(shí)施中國近海褐斑鲬種群保護(hù)和開發(fā)利用措施提供了科學(xué)依據(jù)。但僅采用母系遺傳的分子標(biāo)記進(jìn)行分析，并不能反映褐斑鲬的雙親遺傳特征，因此在后續(xù)的研究中可考慮使用高多態(tài)性的SSR和基于基因組或者轉(zhuǎn)錄組的SNPs，以揭示更加全面的遺傳信息，反映環(huán)境條件差異和變化的影響情況；另外，受限于其中小部分樣本數(shù)較少，本研究結(jié)果存在一定的不確定性，今后需要進(jìn)一步針對南海北部近海褐斑鲬種群進(jìn)行更多采樣，分析其遺傳背景，為制定精準(zhǔn)的管理策略提供更加充分的科學(xué)根據(jù)。