轉(zhuǎn)氨酶固定化及其連續(xù)流催化合成(R)-1-(4-溴苯基)乙胺

張加強(qiáng),陸 群,趙 昱

(1.西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 成都 610031;2.云南省藥用昆蟲(chóng)及蛛形類(lèi)資源開(kāi)發(fā)利用工程實(shí)驗(yàn)室,云南 大理 671000)

(R)-1-(4-溴苯基)乙胺是許多具有藥物活性和生物活性化合物的重要合成中間體,例如可以用于合成新型廣譜喹諾酮類(lèi)抗菌藥加雷沙星以及新型突變體B-Raf(V600E)強(qiáng)選擇性激酶抑制劑[1-2]。轉(zhuǎn)氨酶催化前手性酮的直接胺化為手性純胺的合成提供了一個(gè)較優(yōu)的選擇[3],但水溶性的酶分子在苛刻的反應(yīng)條件下穩(wěn)定性和選擇性較差,同時(shí)儲(chǔ)存、回收和清除細(xì)胞碎片也相當(dāng)困難[4-5]。連續(xù)流生物催化具有催化效率快、時(shí)空產(chǎn)率高,易于下游處理(便于分離)等優(yōu)點(diǎn)[6],已成為綠色可持續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)的重要研究領(lǐng)域。因此將酶固定在樹(shù)脂載體上用于連續(xù)流催化合成(R)-1-(4-溴苯基)乙胺具有一定的研究?jī)r(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

LC-20AD型高效液相色譜儀、SPD-M20A檢測(cè)器,日本島津;CMax Plus酶標(biāo)儀,美谷分子儀器;ES-1、ES-103B、ESR-2,天津南開(kāi)和成;LX-1000EP、LX-1000HA,西安藍(lán)曉;ReliZyemTMOD-403,日本三菱化工;ATA-117轉(zhuǎn)氨酶由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒,生工生物工程;其他常規(guī)試劑均為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化載體的篩選

配制100 mmol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖液5 mL,加入0.5 g樹(shù)脂載體和20 mg轉(zhuǎn)氨酶,混合后置于30 ℃下攪拌24 h,過(guò)濾洗滌,加入50 mmol/L、pH 8.5的磷酸鹽緩沖液5 mL(含3 mol/L甘氨酸),30 ℃下攪拌20 h,抽濾洗滌,得到固定化酶[7]。

1.2.2 酶蛋白質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)氨酶固定化的影響

配制100 mmol/L,pH 8.0的磷酸鹽緩沖液,分別加入定量轉(zhuǎn)氨酶凍干粉制成4,6,8,10,12,14 g/L的均一酶液。分別取2 mL酶液加入0.2 g ES-103B樹(shù)脂,置于30 ℃下攪拌24 h。

1.2.3 緩沖液鹽濃度對(duì)轉(zhuǎn)氨酶固定化的影響

配制pH 8.0,濃度為100,200,500,800,1 000,1 500 mmol/L的磷酸鹽緩沖液。分別取2 mL緩沖液加入0.02 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.2 g ES-103B環(huán)氧樹(shù)脂載體,置于30 ℃下攪拌24 h。

1.2.4 緩沖液pH對(duì)轉(zhuǎn)氨酶固定化的影響

配制濃度為500 mmol/L,pH為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的磷酸鹽緩沖液。在2 mL緩沖液中加入0.02 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.2 g ES-103B環(huán)氧樹(shù)脂載體,置于30 ℃下攪拌24 h。

1.2.5 固定化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)氨酶固定化的影響

配制濃度為500 mmol/L,pH為7.0的磷酸鹽緩沖液,在2 mL磷酸鹽緩沖液中加入0.02 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.2 g ES-103B樹(shù)脂載體,置于30 ℃下攪拌,分別在0,2,4,6,8,12,18,24 h時(shí)取出,結(jié)束固定化過(guò)程。

1.2.6 最適反應(yīng)pH

稱(chēng)取0.2 g固定化酶,分別加入pH為6.0,7.0,8.0,8.5,9.0,9.5,10的磷酸鹽緩沖溶液(含20 mmol/L對(duì)溴苯乙酮,1 mol/L異丙胺,體積分?jǐn)?shù)10%的DMSO)1 mL,置于45 ℃下反應(yīng)1 h。

1.2.7 最適反應(yīng)溫度

稱(chēng)取0.2 g固定化酶,加入100 mmol/L,pH 9.0的磷酸鈉緩沖液(含20 mmol/L對(duì)溴苯乙酮,1 mol/L異丙胺,10% DMSO)1 mL。在溫度分別為30,40,50,60,70 ℃條件下反應(yīng)1 h。

1.2.8 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將固定化酶ATA117@ES103B與游離酶ATA-117均加入100 mmol/L,pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中,放置于4 ℃冰箱保存,每隔2 h測(cè)定相應(yīng)酶活。

1.2.9 重復(fù)批次操作穩(wěn)定性

稱(chēng)取0.2 g固定化酶(ATA117@OD403,ATA117@ES103B),加入100 mmol/L,pH 9.0的磷酸鹽緩沖液(含20 mmol/L對(duì)溴苯乙酮,1 mol/L異丙胺,10% DMSO)。置于45 ℃下反應(yīng)1 h,液相檢測(cè)產(chǎn)物濃度,再加入新的反應(yīng)液進(jìn)行重復(fù)批次實(shí)驗(yàn)。

1.2.10 連續(xù)流反應(yīng)系統(tǒng)的建立

以?xún)?nèi)徑5 mm,長(zhǎng)度10 cm的填充柱作為反應(yīng)場(chǎng)所,將固定化酶ATA117@ES103B填充于柱中,放置于50 ℃恒溫箱中,通過(guò)注射泵以一定流速將反應(yīng)液泵入反應(yīng)器中,在出口處收集反應(yīng)液,檢測(cè)產(chǎn)物濃度。

1.2.11 酶活的測(cè)定方法

稱(chēng)取0.2 g固定化酶,加入1 mL反應(yīng)液(100 mmol/L,pH 9.0,含20 mmol/L對(duì)溴苯乙酮,1 mol/L異丙胺,10% DMSO),置于45 ℃條件下反應(yīng)1 h。將反應(yīng)液用等量乙酸乙酯萃取后,加入10 mg K2CO3和5滴乙酸酐,400 r/min下攪拌反應(yīng)1 h,再加入10 mol/L NaOH(200 μL)溶液,離心分離后液相測(cè)定產(chǎn)物濃度。

酶活定義:在45 ℃,pH 9.0條件下,每小時(shí)催化對(duì)溴苯乙酮生成1 μmol的1-(4-溴苯基)乙胺所需的酶量,即為1個(gè)酶活力單位,用U表示。

比酶活:1 g固定化酶(轉(zhuǎn)氨酶凍干粉)所含有的酶活。

酶活回收率=(固定化酶酶活/初始酶液總酶活)×100%。

轉(zhuǎn)化率=(目的產(chǎn)物的實(shí)際生成量/目的產(chǎn)物的理論生成量)×100%。

1.2.12 蛋白吸附率的測(cè)定方法

使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行粗酶液初始蛋白濃度及固定后上清殘余蛋白濃度的測(cè)定。

蛋白吸附率=[(初始蛋白濃度-上清殘余蛋白濃度)/初始蛋白濃度]×100%。

1.2.13 色譜條件

色譜柱為CHIRAlCEl OJ柱;流動(dòng)相為V(異丙醇)∶V(正己烷)=1∶9;流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;柱溫為40 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化載體篩選

由于不同類(lèi)型的樹(shù)脂載體攜帶的官能團(tuán)不同,使得酶蛋白和樹(shù)脂之間的固定化方式存在差異,篩選結(jié)果如表1所示。

表1 樹(shù)脂載體篩選結(jié)果一覽表

氨基樹(shù)脂和烷基樹(shù)脂是借助分子間相互作用力將酶蛋白吸附在載體表面,酶分子很容易從載體表面脫落;而環(huán)氧樹(shù)脂表面富含環(huán)氧基團(tuán),可以在常溫下與酶蛋白氨基酸殘基形成共價(jià)鍵,使酶蛋白共價(jià)連接在載體表面,大大提高了固定化酶的穩(wěn)定性。由表1可知:環(huán)氧基樹(shù)脂ES-103B蛋白結(jié)合能力最強(qiáng),蛋白吸附率為94.50%,同時(shí)其所得固定化酶酶活回收率也最高,酶活回收率為59.84%。因此選用ES-103B環(huán)氧樹(shù)脂作為最佳固定化載體。

2.2 固定化條件的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[8-9],對(duì)ATA-117固定于ES-103B的固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化,包括酶蛋白質(zhì)量濃度、緩沖液鹽濃度、pH以及固定化時(shí)間,結(jié)果如圖1所示。

圖1 固定化條件的優(yōu)化

固定化酶的比活隨著酶質(zhì)量濃度的增加而增加,在10 g/L時(shí)達(dá)到峰值,且蛋白吸附率基本保持不變,保持在90.13%～94.88%,蛋白幾乎被完全吸附;而當(dāng)酶液增加至12 g/L時(shí),比活出現(xiàn)微微下降的趨勢(shì),同時(shí)蛋白吸附率也在減小。緩沖液鹽離子濃度和pH對(duì)固定化的影響中,固定化酶活回收率及比酶活都呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì),在磷酸鹽濃度500 mmol/L,pH 7.0時(shí)達(dá)到最大值。隨著固定化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),固定化酶的酶活與蛋白吸附率呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì),在8 h時(shí)固定化酶達(dá)到最高酶活,此時(shí)蛋白吸附率為95.83%。故確定較優(yōu)的酶固定化條件:m(載體)∶m(轉(zhuǎn)氨酶)=10∶1,固定化時(shí)間8 h,緩沖液濃度500 mmol/L,pH 7.0,溫度30 ℃。

2.3 固定化酶最適反應(yīng)條件

對(duì)固定化酶ATA117@ES103B的最適反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,也考察了其儲(chǔ)存穩(wěn)定性和重復(fù)批次操作穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2所示。由圖2(a)可知:游離酶ATA-117的最適pH為10,而固定化酶ATA117@ES103B的最適pH為9.5,即略向酸性偏移,這可能是因?yàn)槊傅鞍捉?jīng)固定化后其所處微環(huán)境的電荷性質(zhì)發(fā)生了改變而造成的影響。由圖2(b)可知:在對(duì)ATA117@ES103B與游離酶ATA-117的穩(wěn)定性比較實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)游離酶隨著存儲(chǔ)時(shí)間的增加,酶活持續(xù)大幅度降低,在第10天時(shí)殘余酶活為初始值的53.21%,在第15天時(shí)僅有27.43%的酶活殘留;而ATA117@ES103B在前10 d左右酶活沒(méi)有明顯的損失,在存儲(chǔ)15 d后,殘余酶活為初始值的89.83%,展現(xiàn)了出色的存儲(chǔ)穩(wěn)定性。由圖2(c)可知:溫度對(duì)固定化酶活影響較大,故確定最適反應(yīng)條件為:pH 9.5,溫度50 ℃。由圖2(d)可知:在A(yíng)TA117固定于烷基樹(shù)脂載體OD403和環(huán)氧基樹(shù)脂載體ES103B的重復(fù)操作穩(wěn)定性比較實(shí)驗(yàn)中,固定化酶ATA117@OD403在使用至第4次時(shí),還保留了初始值的72.36%的活性,隨后大幅度減小,當(dāng)重復(fù)使用至10次時(shí),殘余酶活僅為7.62%;而ATA117@ES103B在重復(fù)使用至第4次時(shí),保留有94.83%的殘余酶活,當(dāng)重復(fù)操作10次后,殘余酶活為80.41%,具有良好的重復(fù)批次使用穩(wěn)定性。

圖2 固定化酶的最適反應(yīng)條件

2.4 連續(xù)流反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)所建連續(xù)流反應(yīng)器系統(tǒng)的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,包括流向、流速以及填料量,結(jié)果如圖3所示。由圖3(a)可知:在保持其他條件相同的情況下,分別將反應(yīng)液從上至下(下流系統(tǒng))和從下至上(上流系統(tǒng))泵入反應(yīng)器,發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在慢速(0.2 mL/min)、中速(0.5 mL/min)還是快速(1.0 mL/min)的流速條件下,下流系統(tǒng)中洗脫液的轉(zhuǎn)化率均略高于上流系統(tǒng)。由圖3(b)可知:反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨著反應(yīng)器中ATA117@ES103B用量的增加而升高,考慮到使反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的最大化,故采用2.0 g的固定化酶使用量為最佳填料量。由圖3(c)可知:降低流速能夠增加底物與固定化酶的接觸時(shí)間,使其充分反應(yīng)從而提高轉(zhuǎn)化率,然而流速為0.2～0.3 mL/min時(shí),轉(zhuǎn)化率并沒(méi)有明顯變化,因此確定流速為0.3 mL/min,反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為93.43%。

圖3 連續(xù)流條件的優(yōu)化

2.5 最優(yōu)條件下連續(xù)流反應(yīng)器的催化效力及其可持續(xù)性能

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將連續(xù)流生物催化反應(yīng)的工藝條件調(diào)整為:固定化酶填料量為2.0 g,以0.3 mL/min的流速將反應(yīng)液從上至下泵入反應(yīng)柱中,柱溫箱50 ℃。計(jì)算得反應(yīng)器中具有催化能力的有效體積(即固定化酶總體積)約為1.96 mL,則反應(yīng)液在反應(yīng)器中的停留時(shí)間(即反應(yīng)液在反應(yīng)器中與固定化酶接觸并發(fā)生反應(yīng)的時(shí)間)約為6.54 min。分別在連續(xù)流催化模式與間歇反應(yīng)模式下進(jìn)行(R)-1-(4-溴苯基)乙胺的不對(duì)稱(chēng)合成,將反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,如表2所示。在連續(xù)流操作的最佳條件下,20 mmol/L的對(duì)溴苯乙酮在不到7 min的停留時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率即可達(dá)到93%,催化效率為2.804 μmol/(min·g),比相應(yīng)的間歇反應(yīng)高出7倍,計(jì)算時(shí)空產(chǎn)率為789.85 g/(L·d)。

表2 間歇反應(yīng)與連續(xù)流反應(yīng)合成(R)-1-(4-溴苯基)乙胺

3 結(jié) 論

對(duì)6種不同類(lèi)型的樹(shù)脂載體進(jìn)行篩選,確定ES-103B環(huán)氧樹(shù)脂作為最佳固定化酶載體。通過(guò)單因素優(yōu)化確定了較優(yōu)的ATA-117轉(zhuǎn)氨酶固定化條件、所得固定化酶ATA117@ES103B的最適反應(yīng)溫度和pH。構(gòu)建連續(xù)流反應(yīng)系統(tǒng),對(duì)連續(xù)流反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳反應(yīng)條件是:固定化酶填料量2.0 g,流速0.3 mL/min,反應(yīng)液從上至下泵入反應(yīng)器。該研究使得在連續(xù)流反應(yīng)系統(tǒng)中不對(duì)稱(chēng)合成(R)-1-(4-溴苯基)乙胺成為可能,理論上該系統(tǒng)可應(yīng)用于其他更多重要藥物中間體的合成,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。