透明質(zhì)酸酶對馬鹿精子體外獲能影響的研究

孫佳陽，崔 凱，馬楊君，鄒 琦，李和平*

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

哺乳動(dòng)物精子受精前須在雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)進(jìn)行獲能，然后才能獲得受精能力，即精子獲能(capacitation)[1-2]。哺乳動(dòng)物精子獲能現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)是動(dòng)物體外受精研究的里程碑[2]。因而，誘導(dǎo)精子體外獲能技術(shù)是體外受精必須首先解決的關(guān)鍵技術(shù)之一。

透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase）是精子細(xì)胞頂體內(nèi)含有的一種溶酶體酶，它參與溶解含有透明質(zhì)酸的卵丘，在精子受精過程中起著重要作用[3]。精子頂體位于精子頭部前端，覆蓋在精子核前面，是外包有單位膜的囊狀結(jié)構(gòu)[3]。頂體內(nèi)含有多種蛋白水解酶、磷酸脂酶等，透明質(zhì)酸酶便是其中的一種重要酶。當(dāng)精子獲能、發(fā)生頂體反應(yīng)時(shí)，頂體釋放使精子可以穿過卵細(xì)胞的放射冠、溶解含有透明質(zhì)酸的卵丘，使卵泡周圍的顆粒細(xì)胞分散，便于精子進(jìn)入卵子內(nèi)[2-4]。

馬鹿是目前我國人工養(yǎng)殖的主要特種畜禽之一，探究其受精生物學(xué)機(jī)制的基礎(chǔ)研究及其相關(guān)的體外受精技術(shù)具有重要科學(xué)意義與實(shí)踐價(jià)值。但目前有關(guān)透明質(zhì)酸酶對馬鹿精子體外獲能的研究很少。試驗(yàn)采集馬鹿精子，開展了透明質(zhì)酸酶對馬鹿精子體外獲能影響的研究，以期為馬鹿體外受精實(shí)踐提供基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)參考。

1 材料

1.1 精液來源

成年健康雄性種馬鹿1頭，來自黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院哈爾濱特產(chǎn)所鹿場。以人工采精的方法采得馬鹿新鮮精液，用無卵黃精液稀釋液（Andromed?）稀釋后，在0～4 ℃保存（不超過5 d）。

1.2 試劑與精子體外獲能培養(yǎng)液

透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase），購自SIGMA 公司；其他試劑及精子體外獲能培養(yǎng)液的配制，參照參考文獻(xiàn)[5]。

2 方法

2.1 試驗(yàn)方案

采用上浮法（sperm swam-up），在精子獲能液透明質(zhì)酸BO（BO solution）/TALP（臺(tái)式液，Tyrode's albumin lactate pyruvate solution）基礎(chǔ)液+6 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）+10 μg/mL 肝素中，分別添加透明質(zhì)酸酶至終濃度為0（對照組），0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 g/L 的濃度梯度，處理30 min，觀測精子活力、彎尾率以評價(jià)體外獲能效果；并隨之制作培養(yǎng)滴于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2，4，6，8 h鏡檢，記錄精子活率。試驗(yàn)組別設(shè)置見表1。

表1 組別設(shè)置

2.2 精子活力、活率、彎尾率的檢測

為評價(jià)透明質(zhì)酸酶對馬鹿精子體外獲能效果的影響，在顯微鏡下觀測直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)、彎尾精子數(shù)、活精子數(shù)和精子總數(shù)，計(jì)算精子活力、活率、彎尾率以評價(jià)精子質(zhì)量。直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)占精子總數(shù)百分比為精子活力，活精子數(shù)占精子總數(shù)百分比為精子活率，彎尾精子數(shù)占精子總數(shù)百分比為精子彎尾率。精子活力、活率、彎尾率的檢測與計(jì)算參照參考文獻(xiàn)[6-7]。

檢測結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 透明質(zhì)酸酶對精子獲能的影響

3.1.1 BO 液中不同濃度透明質(zhì)酸酶對精子獲能的作用 添加透明質(zhì)酸酶0.50，0.75，1.00，1.25 g/L組精子活力均與對照組差異不顯著（P＞0.05），而添加透明質(zhì)酸酶1.50 g/L 組的精子活力則顯著低于對照組（P＜0.05）。說明精子活力隨著透明質(zhì)酸酶添加濃度的增加有先增加后降低的趨勢。添加透明質(zhì)酸酶0.75，1.00，1.25 g/L 組精子彎尾率較高，顯著高于其他組（P＜0.05），且添加透明質(zhì)酸酶1.00 g/L組的彎尾率最高，見表2。

表2 BO液中不同濃度透明質(zhì)酸酶對精子體外獲能的影響 %

3.1.2 TALP 液中不同濃度透明質(zhì)酸酶對精子獲能的作用 透明質(zhì)酸酶0.50，0.75，1.00 g/L組精子活力均與對照組差異不顯著（P＞0.05），而透明質(zhì)酸酶1.25，1.50 g/L 組精子活力顯著低于對照組（P＜0.05）。說明精子活力隨著透明質(zhì)酸酶添加濃度的增加呈降低趨勢。透明質(zhì)酸酶1.00 g/L 組彎尾率最高，極顯著高于對照組（P＜0.01）；透明質(zhì)酸酶0.75 ，1.25 g/L 組彎尾率顯著高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 TALP液中不同濃度透明質(zhì)酸酶對精子體外獲能的影響 %

3.2 時(shí)間與透明質(zhì)酸對精子活率的影響

3.2.1 BO 液中不同濃度透明質(zhì)酸酶對精子活率的影響 于2，4，6，8 h后鏡檢、記錄精子活率的結(jié)果顯示，添加不同濃度透明質(zhì)酸酶對改善精子活率、延緩精子活率降低沒有效果，見表4。

表4 BO液中不同濃度透明質(zhì)酸酶對精子活率的影響 %

3.2.2 TALP 液中不同濃度透明質(zhì)酸對精子活率的影響 于2，4，6，8 h 鏡檢記錄精子活率的結(jié)果顯示，添加不同濃度透明質(zhì)酸酶對精子活率的影響效果、趨勢與在BO 液中的效果相似，即添加不同濃度透明質(zhì)酸酶對改善精子活率、延緩精子活率降低沒有效果，見表5。

表5 TALP液中透明質(zhì)酸酶對精子活率的影響 %

4 討論

在2020 年5 月國家公布的《國家畜禽遺傳資源目錄》中的人工養(yǎng)殖的馬鹿是主要特種畜禽之一，對其繁殖技術(shù)的研究與實(shí)踐無疑具有重要的意義，其中體外受精是實(shí)現(xiàn)良種快繁的重要技術(shù)領(lǐng)域之一。

精子獲能是哺乳動(dòng)物精子受精之前必須經(jīng)歷、不可或缺的一個(gè)生理階段[2]，精子獲能是精子進(jìn)入超激活狀態(tài)，涉及精子質(zhì)膜的脂質(zhì)組成變化、通透性與流動(dòng)性提高、內(nèi)外離子變化等反應(yīng)[8]。因而在進(jìn)行體外受精研究與實(shí)踐過程中，毫無疑問精子體外獲能就是體外受精的關(guān)鍵前提技術(shù)。鹿是重要的哺乳類經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，對其開展體外受精等技術(shù)的研究同樣具有重要科學(xué)意義。但目前對于鹿精子體外獲能、體外受精的研究仍處于起步階段，諸多技術(shù)難點(diǎn)有待突破。前期的相關(guān)研究已經(jīng)表明，以TALP、BO、高滲液（high ionic strength medium，HIS）和改良克-林二氏重碳酸鹽溶液（modified Krebs - Ringer bicarbonate solution，mKRB）培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液均可使馬鹿精子在體外獲能，而且肝素、咖啡因等也能有效促進(jìn)馬鹿精子體外獲能，并完成體外受精[9]。

透明質(zhì)酸酶是一種能夠降低體內(nèi)透明質(zhì)酸活性，從而提高組織中液體滲透能力的酶[3]。透明質(zhì)酸酶是位于精子原生質(zhì)的水解酶，能夠在受精過程中分解卵子的卵丘，具有水解透明質(zhì)酸的作用，促使精子能夠順利地穿透卵丘，到達(dá)放射冠。透明質(zhì)酸酶是頂體中固有成分，與受精過程中精子穿透卵子有關(guān)[3-4]。因此，在精子獲能培養(yǎng)液中加入透明質(zhì)酸酶可能有利于精子內(nèi)透明質(zhì)酸酶的釋放，加快精子獲能。對牛精子，不論是凍精還是反復(fù)洗滌的鮮精，透明質(zhì)酸酶均能使其活性顯著降低，在使用透明質(zhì)酸酶后活性是否能恢復(fù)到生理值水平、達(dá)到改善受精的目的，是很值得探討的問題[4-8]。而且透明質(zhì)酸酶對精子獲能的頂體反應(yīng)有協(xié)助作用[2-4]。

為了探討透明質(zhì)酸酶對馬鹿精子體外獲能的誘導(dǎo)作用，本試驗(yàn)采用上浮法，在獲能液BO/TALP基礎(chǔ)液+6 mg/mL BSA+10 μg/mL 肝素中，分別添加透明質(zhì)酸酶至終濃度為0，0.50 ，0.75，1.00，1.25，1.50 g/L，測定了精子活力、彎尾率、精子活率等參數(shù)指標(biāo)，以此評價(jià)透明質(zhì)酸酶對馬鹿精子體外獲能的影響。結(jié)果表明，在BO 或TALP 液中0.75～1.25 g/L透明質(zhì)酸酶可提高馬鹿精子體外獲能水平，其適宜的透明質(zhì)酸酶濃度為1.00 g/L，而在BO或TALP液中添加不同濃度透明質(zhì)酸酶對改善精子活率、延緩精子活率降低則沒有效果，為今后開展馬鹿精子體外獲能、體外受精等受精生物學(xué)相關(guān)技術(shù)研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)。