褪黑素對(duì)細(xì)胞的影響和睪丸支持細(xì)胞的調(diào)控

馮 瑞，王子銘，李曉宇，鄭 鵬，張貴學(xué)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

在自然界，褪黑素是一種廣泛存在的分子，由脊椎動(dòng)物松果腺產(chǎn)生，還在細(xì)胞和組織中局部合成，使生物體的生理機(jī)能充分適應(yīng)日常和季節(jié)性的需求。褪黑激素具有兩親性，還具有特定的作用機(jī)制和作用方式，廣泛在生物體中發(fā)揮作用。褪黑素通過(guò)自身受體介導(dǎo)的G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮生理功能，膜受體1和膜受體2實(shí)質(zhì)都是G蛋白，已經(jīng)在脊椎動(dòng)物中得到鑒定。文章對(duì)褪黑素及其介導(dǎo)的信號(hào)通路及睪丸支持細(xì)胞的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期對(duì)后續(xù)相關(guān)研究和生產(chǎn)提供幫助，奠定基礎(chǔ)。

1 褪黑素

1.1 概述

褪黑素簡(jiǎn)稱MT，別稱抑黑素、美拉酮寧以及松果腺素等，是一種由松果腺產(chǎn)生的激素，屬吲哚類，化學(xué)式是N-乙酰-5-甲氧基色胺，親脂能力很強(qiáng)，溶于有機(jī)溶劑，容易受熱失效。在生物鐘、繁殖、免疫、消化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、細(xì)胞抗凋亡、抗炎、抗氧化以及抗腫瘤方面具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。褪黑素在不同種生物體內(nèi)的含量和作用也不同，在動(dòng)物體內(nèi)，能使機(jī)體皮膚所含色素逐漸變淺，在體內(nèi)的含量受到光照的影響，由松果腺體細(xì)胞分泌出的褪黑素屬于內(nèi)分泌激素，會(huì)進(jìn)入血液；視網(wǎng)膜受到光照的作用會(huì)通過(guò)下丘腦影響褪黑素的分泌；褪黑素通過(guò)分布于不同部位的膜受體來(lái)調(diào)節(jié)血壓、性行為、生殖活動(dòng)、季節(jié)性繁殖調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律和入睡覺(jué)醒時(shí)間。褪黑素發(fā)揮作用大部分是通過(guò)激活受體及直接接觸的作用[1-3]。

在1917年研究人員發(fā)現(xiàn)從牛的松果腺提取出的物質(zhì)作用于蝌蚪，減淡了皮膚顏色，在1959年分離并鑒定出褪黑素。早先人們認(rèn)為褪黑素是動(dòng)物神經(jīng)激素，直到1987 年在植物中提取出相同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，由此得知線粒體或葉綠體都能產(chǎn)生褪黑素[4-5]。

1.2 功能

褪黑素可以穿過(guò)細(xì)胞膜和核膜，作用于細(xì)胞。其主要功能：作用于生殖細(xì)胞、下丘腦和垂體、調(diào)節(jié)激素分泌和精子卵子發(fā)生；可以預(yù)防癌癥的發(fā)展，如乳腺癌；通過(guò)刺激谷胱甘肽（GSH）的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)H2O2酶的合成，清除活性氧（ROS），改善線粒體的質(zhì)量，達(dá)到抗氧化作用；通過(guò)受體結(jié)合調(diào)節(jié)免疫器官和免疫細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用；可以與核受體維甲酸受體/維甲酸Z 受體(ROR/RZR)家族結(jié)合，參與晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)；有防治腫瘤、促進(jìn)損傷修復(fù)等重要功能；可以對(duì)其他激素進(jìn)行直接或者間接的分泌調(diào)節(jié)，如卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）等；可以結(jié)合G蛋白偶聯(lián)的膜受體（MT1和MT2）通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活相應(yīng)的信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞相應(yīng)的生理活動(dòng)[6-8]。

1.3 受體

褪黑素受體的種類已經(jīng)明確，有兩類受體：核受體和膜受體。核受體包括RZR 和ROR，膜受體包括膜受體1（MT1）、膜受體2（MT2）和膜受體3（MT3）。MT1 和MT2 實(shí)質(zhì)是G 蛋白，具有高親和力，發(fā)揮作用時(shí)G蛋白發(fā)生偶聯(lián)；MT3主要存在于非哺乳動(dòng)物體內(nèi)，在人體細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MT3 受體的存在，在倉(cāng)鼠的肝臟、腎臟中有發(fā)現(xiàn)。研究表明，MT1存在于視網(wǎng)膜、生殖系統(tǒng)、乳腺、肝臟和腎臟等。在不同組織和細(xì)胞中MT1、MT2 和MT3 受體介導(dǎo)的信號(hào)通路有所不同[9-13]。

1.4 合成

褪黑素體內(nèi)或體外合成受到的影響因素有很多，最重要的是光照，白天光照充足分泌減少，夜晚光照缺少則分泌增多。在此過(guò)程中，松果腺釋放去甲腎上腺素，調(diào)節(jié)褪黑素的增多或者減少。另外，睪丸也能夠合成褪黑激素。

1.4.1 體內(nèi)合成褪黑素的途徑 首先，松果腺體細(xì)胞從血液中吸取色氨酸。

其次，來(lái)自血液中的色氨酸經(jīng)過(guò)色氨酸羥化酶（TPH）催化轉(zhuǎn)化為5-羥色氨酸，后被磷酸吡哆醛和磷酸二甲酯脫羧產(chǎn)生5-羥色胺（即血清素），通過(guò)芳基烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AANAT）轉(zhuǎn)化為N-乙酰血清素。

最后由O-甲基轉(zhuǎn)移酶（ASMT）催化形成褪黑素，釋放到松果腺的毛細(xì)血管中，并以更高的濃度進(jìn)入腦脊液，然后運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體所需部位[4,15]。

1.4.2 體外合成褪黑素途徑 體外可以由色氨酸通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的四步合成途徑合成褪黑素，關(guān)鍵是需要足夠的色氨酸。

第一步：同體內(nèi)合成第一步一致；

第二步：5-HTP 由芳族氨基酸脫羧酶（AAD）被催化為5-羥色胺（5-HT）；

第三步：通過(guò)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（NAT）使血清素（5-羥色胺）被乙?；?；

第四步：通過(guò)羥基吲哚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（ASMT）催化羥基甲基化轉(zhuǎn)化為褪黑素。

2 褪黑素對(duì)細(xì)胞的調(diào)控

2.1 增殖分化調(diào)控

褪黑素通過(guò)受體介導(dǎo)信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化調(diào)控。褪黑素可以介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路[16]。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活后參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化，主要是MT2發(fā)揮作用。c-myc是一種可使細(xì)胞大量增殖和促進(jìn)細(xì)胞分化的基因，也是該信號(hào)通路直接作用的下游靶基因。MT2抑制糖原合酶3磷酸化，使β-鏈蛋白聚集到一定程度，濃度會(huì)逐漸增加，此時(shí)會(huì)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)c-myc轉(zhuǎn)錄，達(dá)到調(diào)控細(xì)胞增殖分化的目的[17-18]。

mTOR 信號(hào)通路中最重要的是雷帕霉素靶蛋白，它是一種保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，復(fù)合物有兩種，分別是mTORC1 和mTORC2?；罨蟮膍TOR 在細(xì)胞增殖、分化及代謝等方面發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。激活PI3K/Akt/m TOR信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，這是一個(gè)主要途徑[19-20]。

MAPK信號(hào)通路參與很多調(diào)控，如增殖、應(yīng)激、生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、炎癥等，屬于酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。調(diào)控細(xì)胞增殖分化主要是通過(guò)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）發(fā)揮作用。

2.2 抗凋亡調(diào)控

在細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)進(jìn)行的程序化死亡，是正常增殖分化的細(xì)胞受到某些基因的調(diào)控導(dǎo)致。

細(xì)胞凋亡存在內(nèi)外兩種途徑，細(xì)胞內(nèi)途徑是通過(guò)線粒體凋亡途徑調(diào)控，細(xì)胞外途徑是通過(guò)細(xì)胞死亡受體介導(dǎo)的途徑調(diào)控。這兩種途徑最后都會(huì)由半胱天冬氨酸蛋白酶家族的激活而促進(jìn)凋亡基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[21]。

褪黑素可以介導(dǎo)胞內(nèi)和胞外信號(hào)通路，緩解細(xì)胞凋亡。

2.2.1 細(xì)胞外途徑 外源性凋亡途徑是通過(guò)啟動(dòng)依賴Caspase酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞凋亡過(guò)程，是一種通過(guò)蛋白互作的信號(hào)通路，直接調(diào)控細(xì)胞凋亡。腫瘤壞死因子受體是死亡受體，存在一種結(jié)構(gòu)域，實(shí)質(zhì)上是死亡結(jié)構(gòu)域，它能與配體特定結(jié)合，激活凋亡信號(hào)通路，如Fas/Fas L[22]。

信號(hào)通路激活以后，F(xiàn)as 受體活化，并快速與細(xì)胞質(zhì)中相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合，這類蛋白既能與Fsa 相結(jié)合，也可以聚集半胱天冬酶8 酶原，形成“Fas受體-死亡結(jié)構(gòu)域蛋白-半胱天冬酶8酶原”結(jié)合體，當(dāng)大量的結(jié)合體聚集，導(dǎo)致局部濃度上升，此時(shí)半胱天冬酶8酶原會(huì)在復(fù)合體中催化形成具有活性的半胱天冬酶8，迅速激活下游因子，啟動(dòng)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞凋亡。

褪黑素作用以后，F(xiàn)as 和Fas L 基因表達(dá)量顯著下調(diào)，“Fas受體-死亡結(jié)構(gòu)域蛋白-半胱天冬酶8酶原”結(jié)合體形成減少，同時(shí)凋亡蛋白表達(dá)也降低，膜通透性改變，線粒體細(xì)胞色素C 釋放減少。這種調(diào)控還會(huì)抑制下游Caspase家族因子的激活。綜上所述，褪黑素抑制Fas/Fas L 信號(hào)活性和Caspase家族蛋白的表達(dá)[23]。

2.2.2 細(xì)胞內(nèi)途徑 細(xì)胞在機(jī)體中也會(huì)受到很多不利的刺激，如機(jī)體內(nèi)缺氧、新陳代謝紊亂、凋亡基因激活、DNA受損等，這些因素會(huì)直接影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致線粒體損傷、膜電位失衡、通透性改變和凋亡因子產(chǎn)生，最終激活線粒體凋亡途徑[21,24]。

細(xì)胞內(nèi)最主要的凋亡途徑就是線粒體凋亡。當(dāng)線粒體凋亡途徑被激活時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡蛋白翻譯和基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用，控制線粒體膜的通透性，最終調(diào)節(jié)線粒體細(xì)胞色素C的釋放。

線粒體基質(zhì)可以合成褪黑素，外源補(bǔ)充的褪黑素也會(huì)集中在線粒體中。褪黑素可刺激抗氧化酶，使沉默調(diào)節(jié)蛋白3（SIRT3）水平升高。外源性褪黑素會(huì)通過(guò)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入線粒體，通過(guò)影響解偶聯(lián)蛋白（UCP）影響線粒體膜電位。而且基質(zhì)中的褪黑素可能會(huì)從線粒體中泄漏出來(lái)，與受體相互作用，控制細(xì)胞色素C的釋放，減少促凋亡蛋白的表達(dá)，保證DNA 分裂正常，減少細(xì)胞的凋亡[25-26]。

2.3 抗氧化調(diào)控

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，內(nèi)源性的ROS 主要來(lái)源是線粒體，ROS通過(guò)線粒體電子傳輸鏈不斷生成，在正常的生理?xiàng)l件下內(nèi)源性抗氧化劑（如GSH）清除ROS，以維持氧化穩(wěn)態(tài)。由于細(xì)胞中ROS 含量不平衡而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，褪黑素可以保護(hù)線粒體正常工作和完整性，抑制ROS 的產(chǎn)生，維持穩(wěn)態(tài)，減少氧化應(yīng)激發(fā)生。

褪黑素對(duì)生理或壓力相關(guān)條件下線粒體損傷和ROS 產(chǎn)生的影響具有積極作用，在生理?xiàng)l件下褪黑激素通過(guò)受體的結(jié)合或與信號(hào)調(diào)節(jié)因子相互作用，短暫刺激少量ROS的產(chǎn)生，以維持參與該激素的合成代謝。

由于快速的新陳代謝或衰老給予細(xì)胞壓力，褪黑素通過(guò)保護(hù)膜電位和ATP水平防止線粒體損傷。以這種方式，褪黑激素限制ROS的量，使其維持在與最佳控制穩(wěn)態(tài)過(guò)程相適應(yīng)的水平，達(dá)到抗氧化作用。褪黑素緩解氧化應(yīng)激的通路不止一條，還有如ERK、MAPK/JNK和Nrf2/HO-1等[27-30]。

2.4 抗炎調(diào)控

褪黑素可刺激酪氨酸磷酸酶活性并降低絲裂原活化蛋白激酶、ERK、p38和JNK的磷酸化水平，抑制NFκB和MAPK信號(hào)通路的激活，維持細(xì)胞內(nèi)抗炎因子和促炎因子的表達(dá)量，在細(xì)胞炎癥的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

3 褪黑素對(duì)睪丸支持細(xì)胞的調(diào)控

3.1 增殖分化調(diào)控

褪黑素可以通過(guò)ERK信號(hào)通路調(diào)控睪丸支持細(xì)胞增殖分化。研究發(fā)現(xiàn)，加入1a000 nmol/L褪黑素處理48 h 后可激活ERK/抑制素α 亞基信號(hào)通路，ERK 的磷酸化水平上升，顯著提升細(xì)胞活力，促進(jìn)雞睪丸支持細(xì)胞增殖；模擬體內(nèi)環(huán)境條件下，在體外將褪黑素和離體山羊睪丸支持細(xì)胞共培養(yǎng)，使細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）的磷酸化水平升高，產(chǎn)生較多膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF），促進(jìn)睪丸支持細(xì)胞增殖[31-32]。

3.2 抗氧化調(diào)控

褪黑素可以通過(guò)Nrf2/HO-1 信號(hào)通路調(diào)控對(duì)睪丸支持細(xì)胞氧化應(yīng)激。研究表明，褪黑素可以有效緩解熱應(yīng)激導(dǎo)致的睪丸支持細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，并恢復(fù)間隙連接和緊密連接[33]；在順鉑誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞氧化損傷時(shí)，丙二醛含量明顯增多，超氧化物歧化酶（SOD）、GSH 和過(guò)氧化氫酶（CAT）等指標(biāo)顯著下調(diào)。加入褪黑素以后，Nrf2/HO-1通路上的Nrf2、HO-1蛋白明顯上調(diào)，解除順鉑對(duì)信號(hào)通路蛋白抑制作用，氧化應(yīng)激指標(biāo)恢復(fù)正常，這充分說(shuō)明了褪黑素是抗氧化的良好治療物[34]。

3.3 抗炎癥調(diào)控

褪黑素可以通過(guò)NFκB 信號(hào)通路調(diào)控炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-6、TNFα和IL-1β的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，DEHP 會(huì)使細(xì)胞NFκB 核易位，使炎癥因子IL-1β和TNF-α 表達(dá)量顯著上調(diào)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，通過(guò)加入褪黑激素可有效降低DEHP 誘導(dǎo)小鼠睪丸的炎癥反應(yīng)。由此可以看出褪黑素可用作減少雄性生殖系統(tǒng)內(nèi)分泌破壞性化學(xué)物質(zhì)的治療藥物[33]。

4 展望及總結(jié)

睪丸支持細(xì)胞是睪丸內(nèi)非常重要的體細(xì)胞，對(duì)于繁殖非常有意義。大量研究已經(jīng)表明，褪黑素對(duì)于其他細(xì)胞在各個(gè)方面有積極作用，但在睪丸支持細(xì)胞上的研究少之又少。通過(guò)以上綜述來(lái)看，研究褪黑素對(duì)細(xì)胞增殖分化、抗凋亡、抗炎以及抗氧化是非常有意義的，褪黑素對(duì)生殖相關(guān)細(xì)胞方面的研究還有待探索，尤其在信號(hào)通路方面和其他外源物質(zhì)相互作用方面，可能不僅僅只存在一種信號(hào)通路發(fā)揮作用，多條通路關(guān)聯(lián)或者相互調(diào)控；不同物種間存在相同或者不同的信號(hào)通路促進(jìn)生殖相關(guān)細(xì)胞增殖分化、抗凋亡、抗炎以及抗氧化。褪黑素在精子的產(chǎn)生、成熟、運(yùn)動(dòng)、品質(zhì)、疾病和生殖相關(guān)內(nèi)分泌有著不可忽視的作用?？傮w而言，研究表明褪黑素對(duì)睪丸功能和雄性生殖有重要影響，隨著研究的深入，褪黑素的作用機(jī)制會(huì)更加深入完善，將會(huì)為畜牧生產(chǎn)實(shí)踐中褪黑素的應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。