Sirtuins在精子發(fā)生中的表達規(guī)律及調(diào)控機制研究進展

胡林林，張 青，廖碧云，余金梅，張麗軍，洪齊富，雷小燦,3*

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心，廣西 百色 533000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563003；3.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽 421001）

精子的發(fā)生高度依賴于糖酵解代謝產(chǎn)生的能量，這個復(fù)雜的過程被稱為類似腫瘤細胞的Warburg效應(yīng)，此過程受到代謝傳感器（如Sirtuins）的調(diào)控。Sirtuins 是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性脫乙?；福哂懈叨鹊谋Ｊ匦?，在哺乳動物中主要有7 種，包括SIRT1～SIRT7[1]。Sirtuins 具有獨特的底物特異性和亞細胞定位，參與了多種生物學(xué)過程，如基因沉默、細胞周期的調(diào)控、代謝、細胞凋亡、癌癥等過程，并與精子發(fā)生過程密切相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Sirtuins在睪丸組織中高表達，Sirtuins 的活性與細胞能量狀態(tài)以及NAD+濃度和NAD+與NADH 水平之間的波動密切相關(guān)，細胞中NADH 的水平主要取決于丙酮酸的去向，以上三個特性決定了Sirtuins在調(diào)控睪丸能量代謝的過程中發(fā)揮著重要作用[3]，暗示了這些蛋白質(zhì)對于維持睪丸正常生精功能不可或缺。文章著重從Sirtuins在精子發(fā)生過程中的表達規(guī)律、功能及相關(guān)的調(diào)控機制進行綜述。

1 Sirtuins家族分子結(jié)構(gòu)

Sirtuins家族分子的催化核心區(qū)域具有高度的相似性：有大小兩個基本結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域由275 個氨基酸殘基組成，大的結(jié)構(gòu)域由Rossmann折疊形成，具有較高的保守性，小的結(jié)構(gòu)域含有一個鋅指結(jié)構(gòu)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物Sirtuins家族7 個亞型（SIRT1～SIRT7）的亞細胞定位不同，其中SIRT2 位于細胞質(zhì)中，SIRT1、SIRT6 和SIRT7 在細胞核中，SIRT3、SIRT4和SIRT5主要分布在線粒體中[6]。在Sirtuins家族中，SIRT1是研究最多的一種酶，廣泛存在于機體的體細胞和生殖細胞中，主要定位于細胞核的常染色體區(qū)。SIRT2 具有催化核心結(jié)構(gòu)部分，這也是Sirtuins家族高度保守的原因之一。SIRT3主要分布在細胞核中，它以257個氨基酸分子（44 kDa）的長鏈形式存在，N端含有一個線粒體靶序列。SIRT4 催化口袋中有一個保守的Ⅱ類區(qū)域，它被預(yù)測為α區(qū)螺旋區(qū)，對酶活性具有潛在的重要意義[7]。SIRT5 基因位于6p23，可編碼310，299 個氨基酸的兩種蛋白亞型。鋅離子結(jié)構(gòu)域和Rossmann 折疊域由14 個α 環(huán)和9 條β 鏈組成，形成底物和NAD+結(jié)合位點[8]。全面了解Sirtuins在睪丸組織中的定位、表達、功能及相關(guān)的信號通路，將有助于解決精子發(fā)生異常及有效改善精子質(zhì)量。

2 Sirtuins在精子發(fā)生過程表達規(guī)律及功能

研究者通過使用不同的方法分析Sirtuins基因在精子發(fā)生過程中的表達規(guī)律。E.L.Bell 等[9]采用免疫印跡法發(fā)現(xiàn)SIRT1在睪丸中呈現(xiàn)高表達；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在未分化的A 型精原細胞中未檢測到SIRT1的表達，B型精原細胞及細線前期細胞中可檢測到低水平表達的SIRT1，粗線期、二倍體和減數(shù)分裂期生精細胞SIRT1表達量最高。B.Ramatchandirin等[10]首次報道SIRT4在睪丸間質(zhì)細胞中表達。P.W.Pan 等[11]報道，采用Western Blot 技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測，SIRT6在睪丸中有表達，并發(fā)現(xiàn)SIRT6定位于晚期圓形精子到早期伸長精子的細胞核和成熟精子的頂體中，從而暗示了SIRT6在精子頂體反應(yīng)中的作用。

最新研究表明，Sirtuins 家族蛋白在男性生殖健康中起著至關(guān)重要的作用：（1）Sirtuins在睪丸組織中高表達；（2）Sirtuins 的活性與細胞能量狀態(tài)、NAD+濃度和NAD+與NADH 水平之間的波動密切相關(guān)；（3）NADH 水平主要取決于丙酮酸是轉(zhuǎn)化為乳酸還是丙氨酸的過程。這三個特性決定了Sirtuins在調(diào)控睪丸精子發(fā)生過程起到了重要作用[12]。SIRT1缺失可導(dǎo)致垂體-下丘腦-睪丸軸功能紊亂，使促性腺激素、促卵泡激素和黃體生成素的水平降低、睪酮的合成受阻；雄性小鼠敲除SIRT1后，睪丸重量減輕、精子數(shù)量減少、異常精子比例增加、生育力降低[13]。高糖環(huán)境可使睪丸中PGC-1α/SIRT3軸發(fā)生紊亂，睪丸SIRT3水平降低可導(dǎo)致睪丸線粒體功能受損，睪丸氧化應(yīng)激增加，精子畸形率增加[14]。

以上這些研究表明，Sirtuins在睪丸組織、生精細胞及成熟精子的頂體中均有高表達，參與性激素水平的調(diào)控，可能通過降低線粒體損傷、氧化應(yīng)激等途徑調(diào)控精子的發(fā)生及成熟。

3 Sirtuins參與精子發(fā)生的可能的調(diào)控機制

3.1 Sirtuins對細胞增殖和凋亡的影響

Sirtuins通過NAD+依賴的去乙?；磻?yīng)，其活性變化對細胞增殖、凋亡和細胞代謝具有重要調(diào)控作用、亦可調(diào)控細胞的DNA 修復(fù)、氧化應(yīng)激、衰老等過程[15]。C.Tatone 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，敲除SIRT1后可使精子在第二次減數(shù)分裂前期發(fā)生阻滯，精子細胞發(fā)生退化或死亡，顯著減少小鼠精子數(shù)量，這與睪丸中細胞形態(tài)異常、細胞凋亡、DNA損傷密切相關(guān)；同時促凋亡基因p53活性的上調(diào)可激活細胞的乙酰化作用，抑制SIRT1的表達，從而導(dǎo)致雄性生殖細胞死亡。SIRT3可影響線粒體的功能，如ATP 的產(chǎn)生、活性氧的調(diào)節(jié)、細胞死亡和生酮作用[17]。SIRT3過表達可增強細胞ATP生成、葡萄糖攝取、糖原形成、乳酸生成，促進胃癌細胞增殖[18]，在SIRT3敲除后p21和Bax的表達顯著升高，Bcl-2的表達降低，導(dǎo)致EC9706細胞的增殖抑制和細胞凋亡[19]。

綜上所述，Sirtuins 在精子發(fā)生過程中通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達，來促進細胞增殖，維持睪丸生精細胞形態(tài)，減少雄性生殖細胞的死亡。

3.2 Sirtuins對細胞氧化損傷的影響

最近的研究表明，Sirtuins主要通過調(diào)節(jié)炎癥，氧化應(yīng)激和線粒體功能而參與衰老相關(guān)的各種疾病[20]。Sirtuins 參與調(diào)控細胞的氧化應(yīng)激過程，SIRT1、SIRT3 和SIRT5 可保護細胞不受活性氧（ROS）的影響，SIRT2、SIRT6 和SIRT7 可調(diào)控氧化應(yīng)激的關(guān)鍵基因[21]。SIRT1 激活劑可改善細胞線粒體DNA 含量，提高ATP 水平、降低ROS 形成；SIRT2 可通過調(diào)控G6PD K403 乙?；絹砭S持還原型輔酶Ⅱ（NADPH）穩(wěn)態(tài)，降低細胞內(nèi)ROS 水平，從而保護細胞免受氧化損傷[22]。研究表明，AMPK可通過激活SIRT3抑制心肌肥大，改善氧化損傷引發(fā)的心臟功能障礙[23]。SIRT4 既可誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧，又具備抗氧化作用，SIRT4 抑制超氧化物歧化酶2（SOD2）與SIRT3的結(jié)合，導(dǎo)致乙酰化增加，從而降低了SOD2活性，SIRT4參與并影響脂肪酸的代謝，ROS的生成增加，顯著影響心臟功能[24]。SIRT5敲除后，可導(dǎo)致細胞ROS 水平升高，降低NADPH 水平，清除ROS 能力下降，增加細胞對氧化應(yīng)激的敏感性[25]。敲除SIRT6的人間充質(zhì)干細胞中的ROS水平升高，氧化還原代謝紊亂，氧化應(yīng)激敏感性增強[26]。

綜上所述，Sirtuins 在細胞的氧化應(yīng)激過程中具有重要調(diào)節(jié)作用，可以降低細胞內(nèi)ROS的形成，保護細胞免受氧化應(yīng)激的損傷，在精子的發(fā)生及成熟過程中Sirtuins對氧化應(yīng)激的調(diào)控作用還需進一步研究。

3.3 Sirtuins對信號通路的影響

SIRT1 被認為是PI3K/AKT 通路的負調(diào)控因子，它通過去乙?；[瘤抑制因子PTEN 及下調(diào)AKT和磷酸化水平來抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞中的PI3K/AKT 通路，白藜蘆醇上調(diào)SIRT1水平可以降低PI3K 和AKT 的磷酸化，當(dāng)HepG2 細胞中SIRT1受到抑制時，PI3K 和AKT 的磷酸化顯著升高[27]。RAO Y.等[28]研究證實，白藜蘆醇可激活SIRT1，SIRT1 進一步激活LKB1/AMPK 通路，即SIRT1 對LKB1/AMPK 通路有正向調(diào)控作用。另有研究證明，白藜蘆醇也可增加小鼠脂肪組織和肝臟中NAD+/NADH 比值，提高SIRT1 活性，使LKB1 乙酰化，激活A(yù)MPK通路[29-30]。

研究顯示，HL60/A 細胞中shRNA 對SIRT2 的消耗導(dǎo)致多藥耐藥相關(guān)蛋白1(mrp1）水平降低，藥物積累增強，并引發(fā)更多的凋亡。SIRT2表達下降可顯著下調(diào)ERK1/2的磷酸化，而過表達則可引起ERK1/2 磷酸化上調(diào)。化學(xué)抑制劑PD98059 可以阻斷ERK1/2 的信號通路，進一步誘導(dǎo)SIRT2 耗竭從而引起HL60/A 細胞凋亡，SIRT2的表達水平與DNR/Ara-C 耐藥和ERK1/2 信號通路活性呈正相關(guān)[31]。He F.F.等[32]用免疫組化染色和Western blot檢測SIRT2在腎小管間質(zhì)纖維化（TIF）患者和單側(cè)尿道梗阻小鼠中的表達情況，發(fā)現(xiàn)SIRT2參與成纖維細胞和TIF 的活化，SIRT2 通過抑制MDM2 信號通路抑制成纖維細胞活化。SIRT3 對自噬的調(diào)控是通過激活LKB1-AMPK-mTOR 信號通路實現(xiàn)的[33]。此外也有研究表明，SIRT3 可通過激活SOD2 以減輕ROS 的積累和抑制PI3K/AKT 信號，從而增加TGF-β 和核轉(zhuǎn)錄因子的易位（Smad）蛋白質(zhì)[34]。

綜上所述，Sirtuins 在不同類型細胞中通過激活不同的信號通路而發(fā)揮作用，Sirtuins 在精子發(fā)生過程中的信號通路還需要進一步深入研究。

3.4 Sirtuins對細胞能量代謝的調(diào)控

睪丸細胞之間的能量代謝及協(xié)同作用是保證正常精子發(fā)生的先決條件，睪丸中支持細胞利用葡萄糖通過糖酵解途徑生成丙酮酸，并在乳酸脫氫酶（LDH）的作用下產(chǎn)生乳酸，而乳酸是睪丸中生殖細胞的主要能量來源[35]。研究表明，Sirtuins家族蛋白在調(diào)控糖酵解通路具有重要作用，小鼠睪丸支持細胞中AMPK基因特異性缺失可導(dǎo)致能量代謝紊亂，細胞內(nèi)部乳酸和脂滴集聚，ATP生成減少，同時SIRT1表達降低，小鼠生育力下降[36]。SIRT1缺失下調(diào)GLUT1、GAPDH、PKM2、HK2的表達；SIRT1可導(dǎo)致糖酵解的負調(diào)控因子p53去乙?；⑹Щ?，保護HIF-1α 不發(fā)生乙?；徒到?，增加GLUT1的表達[37-38]。

綜上所述，精子發(fā)生依賴于睪丸細胞之間的能量代謝，Sirtuins家族蛋白參與調(diào)控糖酵解通路，因此，Sirtuins 對精子的發(fā)生及成熟具有重要的調(diào)控作用。

4 展望

精子的發(fā)生高度依賴于糖酵解代謝產(chǎn)生的能量，在此過程中主要受到代謝傳感器Sirtuins調(diào)控，目前Sirtuins 家族在各研究領(lǐng)域已成為研究熱點，已有研究結(jié)果顯示SIRT1、SIRT6在睪丸中呈現(xiàn)高表達，SIRT4在睪丸間質(zhì)細胞中表達，SIRT1的缺乏導(dǎo)致小鼠生精功能障礙、生精細胞數(shù)量減少、成熟精子減少、增加了附睪精子的DNA 損傷。但目前Sirtuins 對精子發(fā)生的調(diào)控機制尚不明確，還需進一步深入研究Sirtuins家族在精子發(fā)生過程中的作用機制、調(diào)控機制，這對進一步闡明精子發(fā)生及相關(guān)疾病的診治都有重要的指導(dǎo)意義。