牙鲆50K SNP芯片的研制及其在抗病基因組選擇中的應(yīng)用

周茜 ，陳亞?wèn)| ，盧昇 ，劉洋 ，徐文騰 ,b，李仰真 ，王磊 ，王娜 ,b，楊英明 ，陳松林 ,b,*

a Key Laboratory for Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China

b Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266373, China

1.引言

單核苷酸多態(tài)性（SNP）芯片是一種高質(zhì)量、便捷的基因分型平臺(tái)。使用SNP芯片，可同時(shí)檢測(cè)樣本中成千上萬(wàn)的SNP，從而實(shí)現(xiàn)高通量和高效率的基因組研究和良種選育。SNP芯片已被成功用于多種經(jīng)濟(jì)物種的種質(zhì)鑒定、復(fù)雜性狀解析、分子標(biāo)記輔助選育（MAS）和基因組選擇（GS）。基因組選擇利用全基因組范圍內(nèi)的遺傳標(biāo)記來(lái)預(yù)測(cè)基因組估計(jì)育種值（GEBV），并選擇具有高GEBV的個(gè)體進(jìn)行育種[1]。基因組選擇在育種中的應(yīng)用非常成功，例如，在許多國(guó)家，奶牛育種主要依賴基因組選擇和奶牛商業(yè)化SNP芯片[2,3]。

在過(guò)去幾年中，中國(guó)已經(jīng)完成了20多種魚類的全基因組測(cè)序[4]。全基因組序列的獲得，促進(jìn)了養(yǎng)殖魚類基因組選擇技術(shù)和SNP芯片的研究和發(fā)展。近年來(lái)，研究人員研發(fā)了多種養(yǎng)殖魚類的SNP芯片，如大西洋鮭魚（Salmo salar）[5,6]、鯉魚（Cyprinus carpio）[7]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[8]和鯰魚（Ictaluru spunctatus和Ictalurus furcatus）[9]。然而，目前尚無(wú)鲆鰈魚類SNP芯片及魚類抗病育種基因芯片的報(bào)道。在許多國(guó)家，包括中國(guó)、韓國(guó)和日本，牙鲆是一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，日本和中國(guó)分別于20世紀(jì)70年代初和20世紀(jì)90年代開始進(jìn)行牙鲆的良種選育。然而目前，牙鲆養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展面臨多種挑戰(zhàn)，如種質(zhì)退化、傳染病頻發(fā)和缺乏優(yōu)良品種等。因此，迫切需要先進(jìn)的基因組育種技術(shù)培育優(yōu)良品種，以提高牙鲆養(yǎng)殖的產(chǎn)量和質(zhì)量。已有一些研究嘗試進(jìn)行牙鲆的良種選育和養(yǎng)殖，例如，鑒定一個(gè)抗淋巴囊腫病相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記（Poli9-8TUF），并將其應(yīng)用于MAS[10]；通過(guò)SNP遺傳連鎖圖譜定位了抗鰻弧菌（Vibrio anguillarum）病相關(guān)的數(shù)量性狀基因座（QTL）[11]等。這些研究有助于我們深化對(duì)抗病性狀遺傳結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。但是，標(biāo)記數(shù)量少，限制了選擇育種的效果，而抗病性狀是由多個(gè)基因控制的復(fù)雜性狀，因此迫切需要采用基于全基因組范圍的SNP的基因組選擇進(jìn)行良種選育[12,13]。

我們使用新一代測(cè)序（NGS）技術(shù)完成了牙鲆的全基因組測(cè)序和組裝[14]，并基于大規(guī)?；蚪M重測(cè)序數(shù)據(jù)建立了牙鲆抗細(xì)菌病基因組選擇技術(shù)[15]。本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)、研發(fā)了一款牙鲆50K SNP芯片“魚芯1號(hào)”，以1099個(gè)牙鲆個(gè)體的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選了高質(zhì)量且信息豐富的SNP研制芯片，并驗(yàn)證了其基因分型效果。當(dāng)使用“魚芯1號(hào)”芯片作為分型工具開展牙鲆抗細(xì)菌病基因組選擇時(shí)，獲得了較高的GEBV估計(jì)準(zhǔn)確性。因此，“魚芯1號(hào)”芯片在抗病及其他重要經(jīng)濟(jì)性狀的基因組育種計(jì)劃中具有應(yīng)用潛力。任何感興趣的各方都可以公開獲得“魚芯1號(hào)”芯片。

2.材料和方法

2.1.SNP鑒定

“魚芯1號(hào)”芯片的SNP位點(diǎn)來(lái)自1099個(gè)牙鲆個(gè)體的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，其中包括Liu等[15]報(bào)道的931個(gè)個(gè)體和本研究測(cè)序的168個(gè)個(gè)體（NCBI SRA登錄號(hào)SRP253464）。簡(jiǎn)而言之，從鰭條組織中提取基因組DNA，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法（Illumina公司，美國(guó)）構(gòu)建雙端測(cè)序文庫(kù)。重測(cè)序原始短序列在Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)上產(chǎn)生，然后使用QC-Chain工具進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾[16]以去除低質(zhì)量序列、接頭序列和不明核苷酸（N）等。使用Burrows-Wheeler aligner工具[17]將質(zhì)量控制后的序列比對(duì)到牙鲆參考基因組（NCBI登錄號(hào)GCA_001904815.2），然后使用GATK軟件（默認(rèn)參數(shù)）[18]預(yù)測(cè)SNP，以最小比對(duì)質(zhì)量值20、SNP質(zhì)量得分20和堿基質(zhì)量得分30等參數(shù)進(jìn)行SNP質(zhì)量過(guò)濾，獲得初始SNP集。

2.2.SNP篩選

通過(guò)多個(gè)步驟及參數(shù)對(duì)初始SNP集進(jìn)行篩選。首先，使用PLINK（v1.07）計(jì)算最小等位基因頻率（MAF）和缺失率[19]，去除MAF≤0.05和缺失率≥0.1的SNP；使用VCFtools（v0.1.14）[20]-hwe參數(shù)檢測(cè)哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium, HWE），并刪除嚴(yán)重偏離HWE（p< 0.01）的SNP；將過(guò)濾后的SNP及其上下游35 bp側(cè)翼序列提交至Affymetrix Axiom?myDesign GW生物信息分析流程（Thermo Fisher Scientific Inc.，美國(guó)）進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。在該流程中，每個(gè)SNP被分配一個(gè)p-convert值（介于0和1之間），表示給定的SNP在Affymetrix Axiom芯片系統(tǒng)上轉(zhuǎn)換為可靠SNP位點(diǎn)的概率，該值綜合考慮了SNP序列、結(jié)合能、預(yù)期的非特異性結(jié)合程度以及與多個(gè)基因組區(qū)域的雜交情況等。根據(jù)流程中的p-convert值和其他一些質(zhì)量控制指標(biāo)，SNP被分類為“recommended”[p-convert值大于0.6，無(wú)干擾多態(tài)性（wobble）和polycount = 0]、“not recommended”（p-convert值小于0.4，或者無(wú)wobble大于等于3，或者polycount > 0，或者重復(fù)計(jì)數(shù)大于0）、“not possible”（在給定的鏈上不能構(gòu)建探針來(lái)分型該方向上的SNP）和“neutral”（其他）。僅保留“recommended”或“neutral”類SNP的探針以供進(jìn)一步分析。同時(shí)，要求候選SNP的側(cè)翼序列沒(méi)有其他變異或重復(fù)元件，側(cè)翼序列的GC含量為30%～70%。

在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步過(guò)濾，以確保SNP在整個(gè)基因組中分布均勻。我們排除了大多數(shù)A/T和C/G類型的SNP，因?yàn)檫@些標(biāo)記在Affymetrix Axiom芯片平臺(tái)上占據(jù)的空間是其他類型標(biāo)記的兩倍。將最終選擇的SNP探針與2000個(gè)DQC探針（陰性對(duì)照）錨定在芯片上。最后，我們使用SNPeff（v4.2）預(yù)測(cè)芯片上SNP對(duì)牙鲆基因功能的潛在影響[21]。

2.3.SNP芯片分型效果評(píng)估

為了評(píng)估“魚芯1號(hào)”芯片的分型效果，我們對(duì)168個(gè)牙鲆個(gè)體進(jìn)行了基因分型，包括從基因組重測(cè)序樣品中隨機(jī)選擇的96個(gè)（用于初始SNP集發(fā)掘）和從基因組選擇參考群體中隨機(jī)選擇的72個(gè)[15]。

從每個(gè)樣品中提取基因組DNA，并根據(jù)Affymetrix Axiom?2.0檢測(cè)方案進(jìn)行標(biāo)記，最終DNA濃度為50 ng?μL?1，體積為10 μL。DNA雜交和芯片掃描在Affymetrix GeneTitan芯片系統(tǒng)（Thermo Fisher公司，美國(guó)）上完成，生成原始數(shù)據(jù)CEL文件。這些文件被導(dǎo)入Axiom Analysis Suite軟件中進(jìn)行質(zhì)量控制和基因分型。樣品質(zhì)量控制參數(shù)為：DQC值≥0.82、檢出率≥0.97、合格樣品的百分?jǐn)?shù)≥95%、合格樣品的平均檢出率≥98.5%（遵循“最佳實(shí)踐工作流程”），并采用默認(rèn)的SNP質(zhì)量控制閾值過(guò)濾基因分型結(jié)果。

通過(guò)信號(hào)強(qiáng)度和聚類分析評(píng)估SNP的探針轉(zhuǎn)化質(zhì)量，并計(jì)算雜合/純合基因型的數(shù)量。根據(jù)這些指標(biāo)，將SNP分為6類：“PolyHighResolution”（SNP具有良好的聚類分辨率，并且至少有兩個(gè)樣本具有最小等位基因）、“MonoHighResolution”（SNP具有良好的聚類分辨率，但是具有最小等位基因的樣本不到兩個(gè)）、“NoMinorHom”（SNP具有良好的聚類分辨率，但沒(méi)有樣本具有最小等位基因）、“OffTargetVariation”（OTV，被稱為脫靶變異集群）、“CallRateBelowThreshold”（SNP的檢出率低于閾值，但是其他屬性高于閾值）和“Other”（一個(gè)以上聚類屬性低于閾值）[22]。

為了進(jìn)一步測(cè)試SNP芯片的基因分型質(zhì)量和準(zhǔn)確性，我們從基因組重測(cè)序樣本中隨機(jī)挑選了96個(gè)個(gè)體，并比較了由這兩種方法獲得的基因型的一致性。

葡萄作為一種喜光植物，所以在促成栽培的過(guò)程中進(jìn)行良好的光照調(diào)節(jié)是非常有必要的。為了更好的保證棚內(nèi)葡萄可以得到充分的光照，果農(nóng)每年都應(yīng)該為大棚更換新的無(wú)滴膜，在這個(gè)基礎(chǔ)上也可以通過(guò)在葡萄藤下設(shè)置反光膜和膜下滴灌技術(shù)來(lái)更好的保證葡萄的光合作用。

2.4.群體結(jié)構(gòu)分析

基于芯片分析獲得了168個(gè)個(gè)體的基因分型數(shù)據(jù)，我們利用GCTA [23]工具進(jìn)行了主成分分析（PCA），并繪制了第一個(gè)和第二個(gè)成分的主成分分析圖。

2.5.“魚芯1號(hào)”在抗病基因組選擇中的應(yīng)用

我們?cè)谇捌诠ぷ髦?，利用全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，研究了基因組選擇技術(shù)在牙鲆抗遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）選育中的應(yīng)用前景[15]。在本研究中，我們使用“魚芯1號(hào)”芯片對(duì)72個(gè)候選個(gè)體進(jìn)行了基因分型，其中27個(gè)個(gè)體（包括14尾雄魚和13尾雌魚）是16個(gè)家系的親本。使用加權(quán)基因組最佳線性無(wú)偏預(yù)測(cè)（wGBLUP）估算GEBV，將雙親GEBV均值作為相應(yīng)家系的GEBV。估計(jì)育種值（EBV）利用包含四代系譜數(shù)據(jù)的最佳線性無(wú)偏預(yù)測(cè)（ABLUP）進(jìn)行估算，(G)EBV估計(jì)的模型為：

式中，y是表型向量，其中包含個(gè)體表型值（0表示在感染實(shí)驗(yàn)中死亡，1表示存活）；b是固定效應(yīng)向量（包括均值、不同的感染實(shí)驗(yàn)批次以及感染時(shí)的年齡）；g是隨機(jī)效應(yīng)向量；e是隨機(jī)殘差。對(duì)于wGBLUP [24]，假定隨機(jī)效應(yīng)向量服從N(0,G*σg2)，其中G*為通過(guò)迭代算法得到的加權(quán)基因組關(guān)系矩陣[25]。對(duì)于ABLUP，假設(shè)g服從N(0,Aσg2)，其中A是具有四代譜系的親緣關(guān)系矩陣；σg是加性遺傳方差；X和Z是構(gòu)造矩陣，分別用于聯(lián)系表型和固定效應(yīng)以及表型和個(gè)體隨機(jī)效應(yīng)。使用R腳本構(gòu)建加權(quán)G矩陣，并在R-ASReml中估算(G)EBV [26]。

由于已經(jīng)對(duì)16個(gè)子代牙鲆家系進(jìn)行了遲緩愛德華氏菌感染實(shí)驗(yàn)，wGBLUP和ABLUP的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性可以通過(guò)家系GEBV和感染存活率進(jìn)行評(píng)估。將受試者工作特征曲線（AUC）下面積[27]用作衡量wGBLUP和ABLUP預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的指標(biāo)。為了估計(jì)AUC，將16個(gè)家系的平均感染存活率（44.33%）作為閾值，高于和低于平均值的家系分別記為1和0。使用R-pROC估算AUC [28]。

3.結(jié)果與討論

本研究旨在研發(fā)牙鲆高質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化的SNP芯片，并驗(yàn)證其在基因組選擇育種中的應(yīng)用效果。影響SNP芯片設(shè)計(jì)和質(zhì)量的因素很多，如初始SNP集的質(zhì)量、SNP過(guò)濾和篩選參數(shù)以及芯片生產(chǎn)技術(shù)等。Affymetrix公司和Illumina公司提供了兩種最常用的SNP芯片制作平臺(tái)。兩種平臺(tái)均使用靶標(biāo)雜交技術(shù)檢測(cè)位點(diǎn)特異性探針，并且探針強(qiáng)度反映了相應(yīng)等位基因的豐度[29]。在Affymetrix芯片中，指定位置的探針平鋪在芯片表面以獲得SNP信息，而Illumina芯片則使用微珠固定探針，這些SNP基因分型平臺(tái)已被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)研究。高通量NGS是一種用于鑒定全基因組SNP的有效技術(shù)，可用于為SNP芯片篩選SNP。

3.1.測(cè)序和SNP預(yù)測(cè)

我們對(duì)168條牙鲆進(jìn)行全基因組重測(cè)序，在質(zhì)量控制后獲得了974.9 Gb的測(cè)序數(shù)據(jù)。將這些數(shù)據(jù)與來(lái)自90 個(gè)育種家系的931個(gè)個(gè)體的測(cè)序數(shù)據(jù)相結(jié)合，這931 個(gè)個(gè)體具有系譜信息并且具有不同的抗病表型[15]。最后，將1099個(gè)個(gè)體的3.54 Tb測(cè)序數(shù)據(jù)（見附錄A中的表S1）與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，鑒定了超過(guò)4220萬(wàn)個(gè)SNP。不同家系個(gè)體的大規(guī)?；蚪M重測(cè)序使我們能夠獲得高質(zhì)量的候選SNP集，這對(duì)于芯片的SNP篩選非常有利。

3.2.SNP的篩選和芯片設(shè)計(jì)

初步鑒定的SNP集使用以下篩選步驟：首先，我們過(guò)濾并保留了MAF≥0.05、缺失率小于0.1和未顯著偏離HWE（p< 0.01）的SNP。MAF過(guò)濾排除了變異頻率很低的SNP，缺失率高表明該基因型在群體中的數(shù)量有限，HWE過(guò)濾排除了由測(cè)序錯(cuò)誤和自然選擇引起的SNP。因此，這些過(guò)濾去除了可能影響結(jié)果的低質(zhì)量SNP。過(guò)濾后得到一個(gè)包含3 410 891個(gè)SNP的候選SNP集，這些SNP被提交到Affymetrixin silico探針設(shè)計(jì)流程，其中959 651個(gè)SNP通過(guò)了p-convert評(píng)估。最后，我們選擇了均勻分布于全基因組的48 697個(gè)SNP，這些SNP的平均p-convert值為0.684。

3.3.“魚芯1號(hào)”芯片的特征

圖1.牙鲆“魚芯1號(hào)”SNP芯片中SNP位點(diǎn)的MAF。（a）MAF的比例；（b）MAF在24條染色體上的分布。

為了評(píng)估SNP在整個(gè)基因組中的分布，我們將芯片上的SNP位點(diǎn)與牙鲆參考基因組進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算了SNP位點(diǎn)間的距離。我們發(fā)現(xiàn)，SNP廣泛分布于牙鲆基因組，且相鄰SNP位點(diǎn)間具有均勻的間隔，平均間隔距離為9.6 kb [圖2（a）]：5125個(gè)SNP間距小于6 kb、5175個(gè)（10.8%）SNP間距為6～7 kb、6315個(gè)（13.1%）SNP間距為7～8 kb、5471個(gè)（11.4%）SNP間距為8～9 kb、5546個(gè)（11.6%）SNP間距為9～10 kb、6017個(gè)（12.5%）SNP間距為10～11 kb、6557個(gè)（13.7%）SNP間距為11～12 kb、5964個(gè)（12.4%）SNP間距為12～13 kb；累計(jì)約96%相鄰SNP的間距大于13 kb。這些SNP均勻地分布在整個(gè)基因組中，在24條染色體中的平均間距的中位數(shù)為9.8 kb[圖2（b）]。對(duì)于SNP之間距離較大的區(qū)域，只有少數(shù)SNP符合篩選標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)芯片上的所有SNP進(jìn)行注釋，并根據(jù)預(yù)測(cè)效應(yīng)將其分為不同的類別（表1）。在48 697個(gè)SNP中，有26 274個(gè)SNP（53.9%）位于基因區(qū)，包括外顯子、內(nèi)含子、剪接位點(diǎn)以及基因上游和下游序列的1 kb區(qū)域。基因區(qū)中兩個(gè)最豐富的類別是內(nèi)含子和同義突變，分別包含23 475個(gè)和1912個(gè)SNP。非基因區(qū)SNP包括1684個(gè)（3.46%）上游（距離起始密碼子1～5 kb）、1754個(gè)（3.60%）下游（距離終止密碼子1～5 kb）和18 985個(gè)（38.99%）基因間SNP。

表1 牙鲆“魚芯1號(hào)”SNP芯片上SNP位點(diǎn)的效應(yīng)類別

3.4.“魚芯1號(hào)”芯片的基因分型效果

采用來(lái)自育種家系的168個(gè)DNA樣本評(píng)估了芯片的分型效果，其中166個(gè)樣本（98.2%）通過(guò)了樣本質(zhì)控，檢出率閾值為97%。針對(duì)基因型檢出率、聚類分離、多態(tài)性以及芯片與重測(cè)序分型的SNP的一致性，評(píng)估了“魚芯1號(hào)”芯片的基因分型效果。

圖2.牙鲆“魚芯1號(hào)”SNP芯片的位點(diǎn)間距分布。（a）24條染色體上的位點(diǎn)間距；（b）具有不同位點(diǎn)間距的SNP分布。

在“ 魚 芯1號(hào) ” 芯 片 的48 697個(gè)SNP中， 有36 383個(gè)SNP（74.71%）通過(guò)了所有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在這些SNP位點(diǎn)中，有41.07%被歸類為多態(tài)性的（“PolyHighResolution”和“NoMinorHom”），有33.64%被歸類為單態(tài)性的（“MonoHighResolution”）。其他位點(diǎn)的基因分型質(zhì)量較差，聚類效果不好，被分類為“OTV”“CallRateBelowThreshold”或“Others”。檢測(cè)到較高比例（33.64%）的單態(tài)SNP，其中一些可能是SNP發(fā)掘過(guò)程中的假陽(yáng)性，或者由于缺乏合適的檢測(cè)標(biāo)記而無(wú)法對(duì)SNP進(jìn)行有效鑒定。另外，我們使用的168 個(gè)個(gè)體與重測(cè)序進(jìn)行SNP發(fā)掘的群體屬于同一群體，因此基因型非常相似；如果對(duì)更多的群體進(jìn)行基因分型，則其中一些SNP可能是多態(tài)的。

我們比較了“魚芯1號(hào)”芯片獲得的基因型和重測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的基因型。在包含96個(gè)樣本的測(cè)試中，應(yīng)用芯片成功對(duì)95個(gè)樣本實(shí)現(xiàn)基因分型。在分型成功的SNP位點(diǎn)中，14 899個(gè)（41.0%）位點(diǎn)與重測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的結(jié)果一致，4002個(gè)（11.0%）、3421個(gè)（9.4%）和3162 個(gè)（8.7%）SNP的一致率分別為0.95～0.99、0.90～0.95和0.85～0.90。綜上所述，70%的SNP的一致率不低于85%，表明“魚芯1號(hào)”芯片和基因組重測(cè)序獲得的SNP分型結(jié)果能夠相互驗(yàn)證。

3.5.群體結(jié)構(gòu)的主成分分析

群體結(jié)構(gòu)分析是許多群體遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)。為了評(píng)估“魚芯1號(hào)”芯片是否可以檢測(cè)群體分離狀況，我們基于168個(gè)個(gè)體的SNP進(jìn)行了主成分分析。根據(jù)第一和第二主成分（PC），將所有樣本分為兩個(gè)組（圖3），分別對(duì)應(yīng)于我國(guó)河北省和山東省的起源/采樣地點(diǎn)，證明了“魚芯1號(hào)”具有表征群體結(jié)構(gòu)的能力。

3.6.“魚芯1號(hào)”芯片在基因組選擇中的應(yīng)用

選擇育種可以對(duì)魚類的重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行遺傳改良。我們基于不同的育種家系和遲緩愛德華氏菌人工感染，完成了牙鲆抗病基因組選擇技術(shù)的研究[15]。為了測(cè)試“魚芯1號(hào)”芯片在基因組選擇中的應(yīng)用效果，我們應(yīng)用芯片對(duì)16個(gè)隨機(jī)選擇的家系的親本（共27個(gè)個(gè)體）進(jìn)行基因分型，并利用參考群體估算了(G)EBV [15]。其中7個(gè)家系的平均存活率是61.13%（命名為抗病家系），其余9個(gè)家系的平均存活率為31.27%（命名為易感家系），抗病家系的平均GEBV（2.10）高于易感家系的平均GEBV（1.56）（表2）。由圖4可知，wGBLUP的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高達(dá)80%，超過(guò)了ABLUP方法（66%），并且與ABLUP方法相比，將SNP芯片和wGBLUP相結(jié)合預(yù)測(cè)育種值的準(zhǔn)確性相對(duì)提高了21.21%。此外，GEBV與EBV之間中等強(qiáng)度相關(guān)（Pearson相關(guān)系數(shù)為0.70），表明基因組選擇方法和ABLUP方法預(yù)測(cè)育種值的準(zhǔn)確性具有差異。我們的結(jié)果與已報(bào)道的魚類抗病基因組選擇研究一致，即與ABLUP方法相比，基因組選擇方法在GEBV估計(jì)方面表現(xiàn)得更好，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性提高了13%～52% [30–32]。上述結(jié)果表明，“魚芯1號(hào)”芯片可用于牙鲆抗病基因組選擇育種。然而，本研究中用于估計(jì)GEBV的個(gè)體數(shù)有限，不能完全模擬牙鲆抗遲緩愛德華氏菌的基因組選擇，因此，需要增加個(gè)體數(shù)目以全面評(píng)估“魚芯1號(hào)”芯片用于基因組選擇的效果。目前，我們正在努力增加參考群體和候選群體的樣本數(shù)量，并使用SNP芯片完成基因分型。

表2 16個(gè)牙鲆家系感染遲緩愛德華氏菌后的存活率及估計(jì)育種值

圖3.使用牙鲆“魚芯1號(hào)”芯片獲得的基因分型結(jié)果開展種群結(jié)構(gòu)主成分分析。“Hebei”“Shandong”分別表示在我國(guó)河北省和山東省收集的個(gè)體。

圖4.使用受試者工作特征曲線評(píng)估wGBLUP和ABLUP對(duì)基因組選擇的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。

4.結(jié)論

本文報(bào)道了牙鲆50K“魚芯1號(hào)”SNP芯片的設(shè)計(jì)和研發(fā)。利用1099個(gè)個(gè)體的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定了超過(guò)4220萬(wàn)個(gè)變異位點(diǎn)的起始SNP集；根據(jù)MAF、基因組位置和Thermo Fisher Axiom?技術(shù)的探針設(shè)計(jì)建議，選擇了48 697個(gè)SNP制作芯片。利用“魚芯1號(hào)”芯片，獲得了168個(gè)樣本的高質(zhì)量的基因分型數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)用于抗病基因組選擇中的效果與已報(bào)道的研究一致，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高于傳統(tǒng)基于系譜的BLUP方法。結(jié)果表明，“魚芯1號(hào)”芯片適用于重要經(jīng)濟(jì)性狀的基因組選擇，可以為牙鲆基因分型和良種選育提供一個(gè)重要的技術(shù)平臺(tái)。

致謝

本研究得到了山東省自然科學(xué)基金（ZR2016QZ003）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31461163005）、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2020TD20和2016HY-ZD0201）、青島海洋科學(xué)技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室支持的鰲山科技人才培養(yǎng)計(jì)劃（2017ASTCP-OS15），以及山東省泰山學(xué)者攀登計(jì)劃項(xiàng)目的支持。

Authors’ contribution

Song-lin Chen obtained the funding, and conceived and instructed the study.Qian Zhou performed the SNP selection and probe design for the SNP array.Ya-dong Chen and Yang Liu prepared the DNA sample.Qian Zhou, Sheng Lu, and Yadong Chen performed the SNP array scanning and analyzed the genotyping data.Sheng Lu performed GEBV calculation.Yang-zhen Li, Lei Wang, and Yingming Yang performed the family construction and bacterial challenging experiment.Wen-teng Xu and Na Wang participated the project managements.Qian Zhou, Sheng Lu, and Song-lin Chen wrote the manuscript.All authors reviewed the manuscript.

Compliance with ethics guidelines

Qian Zhou, Ya-dong Chen, Sheng Lu, Yang Liu, Wenteng Xu, Yang-zhen Li, Lei Wang, Na Wang, Ying-ming Yang, and Song-lin Chen declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A.Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.06.017.