鄱陽湖流域蚌類環(huán)境DNA宏條形碼引物的篩選驗證*

陳金萍，周春花，歐陽珊，黃曉晨，吳小平

(南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330031)

淡水生態(tài)系統(tǒng)是世界上最脆弱的生態(tài)系統(tǒng)[1]，蚌類是世界上最易受威脅的動物類群之一[2].蚌類是一種重要的底棲動物, 在淡水生態(tài)系統(tǒng)中占有非常重要的地位, 它們不但是食物鏈中不可缺少的環(huán)節(jié), 而且對水質(zhì)凈化起著重要的作用，許多種類具有較高的經(jīng)濟價值[3-5].蚌類資源的調(diào)查具有挑戰(zhàn)性，因為它們存在于高濁度或低能見度的生境，并且蚌類種群密度低、斑片狀分布、與相近物種雜交以及存在潛在的隱藏種.傳統(tǒng)調(diào)查方法即直接捕捉會破壞它們的生活環(huán)境，使種群規(guī)模變小，造成二次傷害，耗費大量人力物力，且與現(xiàn)行的禁漁政策相悖.此外，由于蚌類鑒別特征少，高變異性所以難以鑒定，需要專門的分類學(xué)知識[6].因此，亟需一種不違背目前政策的、高效率、低成本和高靈敏度的監(jiān)測方法來評估蚌類生物多樣性.

環(huán)境DNA技術(shù)是最近開發(fā)的一種非侵入、高靈敏、高效率且無損傷的調(diào)查工具.環(huán)境DNA是從環(huán)境樣本(例如土壤、水樣、空氣)中提取的總DNA, 不需要對任何目標(biāo)生物體進(jìn)行分離[7].利用環(huán)境DNA技術(shù)可以從環(huán)境樣品中直接提取DNA片段后利用測序技術(shù)對生物進(jìn)行定性或定量分析.最早將環(huán)境DNA技術(shù)用于淡水生態(tài)系統(tǒng)的是監(jiān)測一種入侵物種——美國牛蛙[8].此后，很多水生物種開始使用環(huán)境DNA技術(shù)研究，但在蚌類中的研究起步稍晚.Carlsson等利用環(huán)境DNA技術(shù)檢測到了歐洲淡水瀕危種珠母珍珠蚌的存在，并且認(rèn)為環(huán)境DNA在物種檢測中可作為一種非常重要的工具[9].隨后環(huán)境DNA作為一種檢測工具在瀕危蚌中的有效性得到Currier等學(xué)者的確認(rèn)[10].Pearrubia等將環(huán)境DNA技術(shù)用來檢測兩種入侵蚌的位置，并認(rèn)為其在入侵種早期的預(yù)防擴散中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11].Shogren等對入侵蚌的環(huán)境DNA在河流中轉(zhuǎn)運方式及濃度變化作了進(jìn)一步的研究[12].Prié等利用環(huán)境DNA宏條形碼評估了西古北界淡水雙殼類2個科的生物多樣性[6].環(huán)境DNA技術(shù)用于蚌類的研究多限于監(jiān)測入侵種和瀕危種，而對于生物多樣性的研究鮮見報導(dǎo).研究環(huán)境DNA方法應(yīng)用于檢測生物多樣性的研究催生了宏條形碼的產(chǎn)生[13].宏條形碼技術(shù)不僅提供了準(zhǔn)確、快速的物種多樣性監(jiān)測手段，還提供了認(rèn)識和解決環(huán)境問題的新方式.在使用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測生物多樣性時，首先需要進(jìn)行的就是針對不同的目標(biāo)種選取DNA識別片段來設(shè)計引物.環(huán)境DNA宏條形碼引物在監(jiān)測、定量過程中存在較大偏好性，選擇適合的引物可識別生態(tài)群落中不同的物種.但環(huán)境中細(xì)胞外源的DNA會不斷降解，在保證物種分辨率的前提下，選擇的分子標(biāo)記越短越好.所以使用宏條形碼技術(shù)分析環(huán)境DNA的研究中，為了避免在不同分類種群中放大偏差，選擇設(shè)計較短的、高度保守序列片段的引物是極其重要的.如果實驗設(shè)計的引物保守度低和特異性不足的話，容易引起堿基錯配甚至引起假陽性和假陰性的實驗結(jié)果.

蚌的分布呈明顯的地域性特征，北美蚌類特有種多集中于美國，而亞洲蚌類最豐富的國家則是中國，且集中分布在長江中下游地區(qū)[14].鄱陽湖是長江中下游主要支流之一.為了篩選出適合蚌類環(huán)境DNA生物多樣性研究的宏條形碼引物，本研究設(shè)計了多對通用引物，通過普通PCR擴增和高通量測序篩選這些引物，并用鄱陽湖流域水樣驗證所篩選引物的效果，以期為蚌類環(huán)境DNA生物多樣性監(jiān)測提供參考.

1 材料和方法

1.1 選擇序列及設(shè)計引物

NCBI上下載中國蚌科27種蚌的母系線粒體基因組序列.選擇線粒體序列是因為每個細(xì)胞的線粒體DNA拷貝比核DNA拷貝多得多，當(dāng)環(huán)境DNA濃度很低或降解時，線粒體DNA更為靶向[15].本研究所在的課題組得出線粒體cox1和nad1基因可作為蚌科DNA條形碼，用于蚌科物種的快速鑒定[16]，所以我們選取線粒體cox1和nad1基因全序列.在前期實驗中發(fā)現(xiàn)蚌科通用引物16S rRNA擴增效果較好，對蚌科物種有較好的辨識度，且產(chǎn)物大小也符合我們設(shè)計的原則[17].在對水樣進(jìn)行高通量測序時發(fā)現(xiàn)，用于魚類環(huán)境DNA多樣性研究的引物cytb能鑒定出蚌科動物[18].因此，我們把這2對引物也列入了篩選對象，詳見表1.設(shè)計引物的具體步驟如下，首先，在下載的27種蚌的線粒體全序列中找到cox1、nad1和cytb基因的保守區(qū)域，在mega中比對(圖1)；然后，使用軟件Primer Primier 5設(shè)計通用引物，設(shè)置參數(shù)如下：引物長度(21±5)bp，擴增產(chǎn)物長度在100～400 bp之間，優(yōu)先選擇不含發(fā)夾結(jié)構(gòu)、無引物二聚體和錯配較少的引物序列；最后，在mega中輸入設(shè)計的引物，查找其保守區(qū)，變異位點位置.引物在靶序列的位置如圖2.

表1 本研究設(shè)計及引用的引物信息

圖1 cyt b 234下游引物的位置

圖2 引物在靶序列中的位置

1.2 普通PCR擴增篩選引物

提取單個蚌科物種(24種，詳見表2)的組織DNA：取酒精固定或-80℃保存的蚌類閉殼肌，使用蛋白酶K消化，試劑盒(TIANamp? Marine Aniamal DNA Kit)提取，最后溶解于70 μL TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆?

表2 用于DNA提取、PCR擴增所用的24個蚌科物種及高通量測序比對結(jié)果

用本研究設(shè)計的通用引物及引用的引物分別對這24個物種進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2 min; 94℃ 變性 30 s，退火(47～56℃)40 s，72℃ 延伸 1 min，35個循環(huán); 71℃ 延伸 10 min；最后4℃保存.PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL，Taq酶0.2 μL，DNA模板2 μL, ddH2O 15.8 μL.PCR反應(yīng)所用的酶為TaKaRa Premix.篩選出可以同時擴增出這24個蚌類物種，且凝膠電泳條帶清晰單一的引物對，并對PCR產(chǎn)物加以測序驗證，確保為目的物種的序列.

1.3 構(gòu)建文庫及高通量測序篩選引物

隨機將這24個蚌科物種的DNA混合，即每個蚌的DNA各1 μL裝至1個管中，用上一步篩選出的引物進(jìn)行高通量測序進(jìn)一步篩選.對原液進(jìn)行PCR擴增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，PCR反應(yīng)體系為25 μL，5×reaction buffer 5 μL, 5×GC buffer 5 μL, dNTP(2.5 mmol/L)2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA模板3 μL，ddH2O 7.75 μL, Q5 DNA酶0.25 μL.PCR程序：98℃ 預(yù)變性5 min；98℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸45 s(35個循環(huán))；72℃再延伸5 min；12℃保存.對目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，然后采用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行測序，之后采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫.最后對原始reads數(shù)進(jìn)行整理過濾及質(zhì)量評估，剔除嵌合體序列，如：1)5’端引物錯配堿基數(shù)> 1的序列；2)含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列等.產(chǎn)生的可操作性分類單元(operational taxonomic units，OTUs)通過BLAST在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找蚌科物種同源序列，以97%的序列相似度作為OTU劃分閾值，該閾值大致相當(dāng)于分類學(xué)中物種(Species)水平的序列差異.且e_value(e值)<1×10-5作為該序列的物種注釋信息.對于NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有序列的棘裂脊蚌(Schistodesmusspinosus)、微紅楔蚌(Cuneopsisrufescens)、矛形楔蚌(Cuneopsisceltiformis)，我們補測了其線粒體基因組全序列.

1.4 水樣采集、傳統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、DNA提取及測序

于2019年4月在鄱陽湖子湖青嵐湖進(jìn)行水樣采集，設(shè)置了6個取樣點，每個樣點的坐標(biāo)如下：1#(28.536°N，116.166°E)、2#(28.471°N，116.164°E)、3#(28.928°N，116.157°E)、4#(28.513°N，116.142°E)、5#(29.472°N，116.110°E)、6#(29.164°N，115.934°E).6個采樣點水體總體較渾濁，水流較湍急，水面浮有水生植物，有漁船，人工養(yǎng)殖帶，時有鳥棲居，岸邊有堤壩或沙帶，水草灌木茂盛，水體連通性較好.每個點用采水器采集1 L中下層水樣，做3次重復(fù)，并在相應(yīng)采樣點同時進(jìn)行傳統(tǒng)方法采集蚌(蚌耙采蚌)，水樣和蚌的采集都在漁船上進(jìn)行，采集活體蚌之后，當(dāng)天返回實驗室進(jìn)行鑒定.選取6個點的水樣用高通量篩選出的引物進(jìn)行驗證.水樣于采集后24 h內(nèi)用0.45 μm的混合纖維素濾膜過濾.使用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)提取環(huán)境DNA.Qubit(Thermo Fisher Scientific)測試DNA濃度.3個重復(fù)樣本混合后提取DNA，并測濃度，然后由上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行高通量測序.PCR反應(yīng)體系和步驟如下，PCR反應(yīng)體系為25 μL，5×reaction buffer 5 μL, 5×GC buffer 5 μL, dNTP(2.5 mmol/L)2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA模板2 μL，ddH2O 8.75 μL, Q5 DNA酶0.25 μL，PCR程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性15 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s(30個循環(huán))；72℃再延伸5 min；10℃保存(注：因引物的退火溫度不同，每個引物會進(jìn)行部分微調(diào)).質(zhì)控步驟與上文一致.測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對驗證，以97%的序列相似度，且e_value(e值<1×10-5)最小的，作為該序列的物種注釋信息(因為e值越小準(zhǔn)確度越高，可信度也越高).在物種注釋中，對于reads<3的OTU不作統(tǒng)計.

2 結(jié)果

2.1 普通PCR擴增篩選引物結(jié)果

用表1所列的11對引物分別對提取的24個蚌科物種的DNA進(jìn)行PCR擴增，有3對引物(cytb、cox1233和16S rRNA)能將這24個蚌科物種都擴增出來，擴增條帶清晰明亮，且擴增產(chǎn)物大小符合預(yù)期大小，如圖3～圖5.其余8對引物均不能完全地擴增出這24個蚌科物種，或者是擴增效果不理想.

圖3 使用引物cyt b 擴增蚌科動物的結(jié)果(M: DNA Marker 500, 1～24編號對應(yīng)的蚌類見表1)

圖4 使用引物cox1233擴增蚌科動物的結(jié)果(M: DNA Marker 1000, 1～24編號對應(yīng)的蚌類見表1)

圖5 使用引物16S rRNA擴增蚌科動物的結(jié)果(M: DNA Marker 500, 1～24編號對應(yīng)的蚌類見表1)

2.2 高通量測序篩選引物

用普通PCR擴增篩選出的cytb、cox1233和16S rRNA三對引物對混合24個蚌科物種的DNA進(jìn)行高通量測序，16S rRNA擴增產(chǎn)物測序共獲得202148條reads，蚌201683條reads；cytb擴增產(chǎn)物測序共獲得55096條reads，其中蚌類有55038條；cox1233擴增產(chǎn)物測序共獲得179354條reads，其中蚌類有179277條.通過BLAST 對OTUs進(jìn)行物種注釋，引物cytb的擴增產(chǎn)物注釋到24種蚌中的23種蚌，只有棘裂脊蚌沒有注釋到，該引物辨識度達(dá)96%；引物cox1233的擴增產(chǎn)物注釋到18種蚌，而沒有注釋到卵形尖嵴蚌、蚶形無齒蚌、高頂鱗皮蚌、射線裂脊蚌、棘裂脊蚌和龍骨蟶蚌，引物辨識度只有75%；引物16S rRNA的擴增產(chǎn)物能注釋到除卵形尖嵴蚌之外的所有物種，該引物辨識度也達(dá)96%.高通量測序比對結(jié)果詳見表2.

2.3 水樣環(huán)境DNA高通量測序

為驗證引物效果，對6個樣點的水環(huán)境DNA使用引物cytb和16S rRNA擴增后進(jìn)行高通量測序.16S rRNA擴增產(chǎn)物測序共獲得461185條reads，其中蚌類的序列有123104條，占26.69%，共注釋到蚌科6屬8種(表3).cytb擴增產(chǎn)物共獲得97263條reads，其中蚌類共6416條，約占6.60%，共注釋到蚌科4屬6種(表3).2對引物共檢出蚌科7屬11種，均注釋到圓頂珠蚌、洞穴麗蚌、背瘤麗蚌.傳統(tǒng)方法在6個點采集到的活體蚌9屬13種(表3).環(huán)境DNA技術(shù)和傳統(tǒng)方法共同鑒定出圓頂珠蚌、背角無齒蚌、洞穴麗蚌、扭蚌、短褶矛蚌.

表3 環(huán)境DNA的鑒定結(jié)果及傳統(tǒng)方法采集的蚌科物種信息

2.4 序列相對豐度

兩對引物注釋到的蚌類物種的序列數(shù)及占所有蚌的序列數(shù)的比例見表4.引物cytb注釋到的背瘤麗蚌和劍狀矛蚌的序列數(shù)較多，分別占蚌總序列數(shù)的54.27%和34.13%；引物16S rRNA注釋到的8個物種中，序列數(shù)占比最多的為圓頂珠蚌(84.76%)，其次是背角無齒蚌(10.86%)，最少的為龍骨蟶蚌(0.01%).傳統(tǒng)方法捕捉到的活體蚌類物種個數(shù)見表4，最多的蚌是洞穴麗蚌(41.18%)，其次是中國尖嵴蚌(16.67%).

表4 水樣環(huán)境DNA檢測物種注釋序列數(shù)和傳統(tǒng)方法捕撈活體數(shù)

3 討論

3.1 引物的偏好性

理想的環(huán)境DNA宏條形碼引物應(yīng)該具有高度保守、高辨別度沒有物種偏好性等優(yōu)點[19].本研究中引物cytb、16S rRNA和cox1233都具有高保守度，即都能將待測物種穩(wěn)定擴增出.在環(huán)境DNA的引物篩選研究中，有研究者用水樣DNA來進(jìn)行引物篩選[20-21]，不同的引物對相同的水樣注釋到的物種存在差異，缺乏一個已知的物種信息名錄，無法判斷引物的辨別度情況.而本研究用已知的多個物種DNA混合后進(jìn)行高通量測序，來進(jìn)一步了解引物的辨別度，引物cytb和16S rRNA辨別度都達(dá)96%，均高于引物cox1233引物的辨別度.我們認(rèn)為影響引物辨別度的因素主要有2個：一是在單物種擴增時，雖然都能很好地擴增出來，但多個物種在引物結(jié)合位點沒有差異；二是在高通量測序時引物存在偏好性.因此，我們建議在篩選環(huán)境DNA宏條形碼引物時，先用一代測序驗證引物的辨別度，再用二代測序了解引物的偏好性.

環(huán)境DNA宏條形碼引物在物種多樣性和豐富度研究中存在較大偏好性，即對單個物種的擴增效果很好，但當(dāng)混和多個物種的DNA后，有些物種無法擴增出，導(dǎo)致后續(xù)高通量測序注釋不到該物種[22-23].本研究結(jié)果表明，高通量測序結(jié)果中引物cytb沒有檢測到棘裂脊蚌，推斷PCR擴增中由于引物的偏好性導(dǎo)致棘裂脊蚌沒有擴增出來.引物cox1233有多個物種沒有檢測出來，表明該引物有多種蚌沒有擴增出，存在較大的引物偏好性.同理16S rRNA沒有檢測到卵形尖嵴蚌，暗示PCR擴增中由于引物的偏好性導(dǎo)致卵形尖嵴蚌沒有擴增出來.引物存在偏好性的原因是通用引物在設(shè)計時為了能同時擴增出盡可能多的物種，簡并度較高，也導(dǎo)致引物對物種的擴增能力存在較大差異.因此使用通用引物對混合物種DNA進(jìn)行PCR時，不可避免地會存在物種擴增效率差異.因此，我們建議在進(jìn)行蚌科環(huán)境DNA宏條形碼研究時，可以用多對通用引物進(jìn)行高通量測序鑒定物種，可以有效地避免由于引物偏好性引起的物種遺漏.且使用多重標(biāo)記即多個引物對，在水生環(huán)境DNA方法中已經(jīng)得到大量應(yīng)用，且可以增加可信度、準(zhǔn)確度以及檢測率[24-26].

3.2 環(huán)境DNA方法與傳統(tǒng)方法在蚌科物種多樣性研究中的比較

本研究使用環(huán)境DNA方法共檢測到蚌科7屬11種，傳統(tǒng)方法共采集到蚌科9屬13種，有5種蚌為兩種方法共同鑒定出，2種方法在6個樣點中鑒定的物種存在一些差異，一是因為環(huán)境DNA會隨著水流移動，它并不能實時地反映該采樣點的物種信息；二是因為環(huán)境DNA容易降解，在不同條件(溫度、紫外線強度、微生物群落等)下降解速率不同[27]；三是采樣策略不同，傳統(tǒng)方法用蚌耙采集，采集的是底層的蚌活體，環(huán)境DNA方法采集的是中下層水樣；四是受PCR引物偏好性的影響，利用通用引物進(jìn)行混合物種 DNA擴增，通常會導(dǎo)致較大的物種擴增效率差異[24].環(huán)境DNA方法在3個(樣點1#、2#、5#)點中檢測到了比傳統(tǒng)方法更多的蚌科物種數(shù)，且環(huán)境DNA方法檢測到了瀕危物種龍骨蟶蚌，而這個物種在傳統(tǒng)方法中沒有采集到.傳統(tǒng)方法采集到的優(yōu)勢種為洞穴麗蚌、中國尖嵴蚌、圓頂珠蚌，這和以前的研究結(jié)果相一致[28]，而環(huán)境DNA方法中，引物cytb檢測到序列占優(yōu)勢的為背瘤麗蚌、劍狀矛蚌、洞穴麗蚌，引物16S rRNA檢測到序列占優(yōu)勢的為圓頂珠蚌、背角無齒蚌、扭蚌.這表明序列的相對豐度和物種的相對豐度并沒有得到很好的體現(xiàn).雖然理論上來說，序列的相對豐度可能會體現(xiàn)物種的相對豐度[29]，但兩者的相關(guān)性沒有得到很好的證明[30-31].很多研究表明PCR的偏好性是造成環(huán)境DNA序列的相對豐度無法體現(xiàn)物種的相對豐度的最主要因素[32].造成PCR偏好性最重要的原因是引物和模板之間存在不同堿基數(shù)量的錯配，錯配數(shù)量少的更易擴增，導(dǎo)致其在PCR過程中過量擴增[33].其次，堿基組成也影響引物結(jié)合效率，比如GC含量過高的模板不易擴增[34].現(xiàn)有環(huán)境DNA分析大多依賴PCR擴增，因此控制和減輕PCR的偏好性是環(huán)境DNA對水生生物多樣性監(jiān)測的主要挑戰(zhàn)之一.

在傳統(tǒng)方法采集到的13種蚌中，絹絲尖麗蚌在NCBI中無線粒體基因片段16S rRNA和cytb，這直接影響環(huán)境DNA方法對絹絲尖麗蚌的注釋，導(dǎo)致環(huán)境DNA方法檢測不到該物種.目前NCBI上記錄了蚌科60個種的線粒體全基因組序列，其中中國蚌有27種，還有很多中國蚌科物種的線粒體基因組信息有待進(jìn)一步完善.使用引物16S rRNA共注釋到蚌科6屬8種，蚌科物種序列占總序列數(shù)的26.69%，而使用引物cytb共注釋到蚌科4屬6種，蚌科物種序列占總序列數(shù)的6.60%，且引物16S rRNA在每個樣點鑒定的物種數(shù)均多于引物cytb.本次水樣環(huán)境DNA高通量測序結(jié)果表明在蚌科環(huán)境DNA生物多樣性鑒定方面引物16S rRNA優(yōu)于cytb，最新報道的歐洲淡水雙殼類的生物多樣性評估中用的也是16S rRNA基因的引物[6].

4 結(jié)論

本研究篩選了11對引物，在對蚌類進(jìn)行普通PCR篩選引物時，8對引物不能穩(wěn)定擴增出所有蚌，3對(cox1233、cytb和16S rRNA)能穩(wěn)定擴增出所有蚌.對這3對引物進(jìn)行混合蚌DNA高通量測序進(jìn)一步篩選，cox1233辨別度不高，而cytb和16S rRNA有較高的辨別度.同時用這2對引物對水樣進(jìn)行高通量測序顯示，引物16S rRNA注釋到的蚌科物種序列占總序列數(shù)的百分比高，且能注釋到更多的物種.引物16S rRNA更適合用于蚌類環(huán)境DNA生物多樣性研究的宏條形碼引物.環(huán)境DNA調(diào)查用約占傳統(tǒng)捕撈調(diào)查1/100～1/10的調(diào)查次數(shù)，1/100000～1/100的調(diào)查時間，檢測到了80%的蚌類種數(shù)，表明環(huán)境DNA方法調(diào)查效率更高.并且用分子生物學(xué)知識來鑒定，準(zhǔn)確度更高.所以在蚌科生物多樣性研究方面，環(huán)境DNA方法可以作為傳統(tǒng)方法的有效補充，但適用于蚌科環(huán)境DNA技術(shù)的數(shù)據(jù)庫還有待于完善，更多適合于蚌科環(huán)境DNA宏條形碼生物多樣性檢測的分子標(biāo)記有待于開發(fā)，多個分子標(biāo)記聯(lián)合使用可增加環(huán)境DNA技術(shù)的準(zhǔn)確度和檢測率.

致謝: 感謝劉雄軍博士在傳統(tǒng)方法采蚌方面給予的幫助，感謝王維開碩士在水樣采集方面的幫助，感謝裘雪梅老師在數(shù)據(jù)處理方面的幫助.