三角褐指藻DGAT1基因生物信息學(xué)分析及表達調(diào)控研究

王何瑜, 龔一富, 鄭小惲, 李申睿

三角褐指藻1基因生物信息學(xué)分析及表達調(diào)控研究

王何瑜1, 龔一富2,3*, 鄭小惲2,3, 李申睿2,3

（1.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院, 浙江 寧波 315832; 2.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波 315832; 3.浙江省海洋生物工程重點實驗室, 浙江 寧波 315832）

本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序獲得了三角褐指藻1基因cDNA全長序列(GeneBank登錄號: 7200924), 并對其進行生物信息學(xué)分析和表達調(diào)控研究. 結(jié)果表明, 三角褐指藻1基因cDNA序列全長為1438bp, 開放閱讀框(ORF)為1098bp, 編碼365氨基酸序列, 含有脂肪酸蛋白特性(I)和DAG結(jié)合位點(II)等功能結(jié)構(gòu)域. 預(yù)測三角褐指藻DGAT1蛋白為親水性蛋白, 含有6個跨膜結(jié)構(gòu)域和7個超強跨膜螺旋區(qū), 無信號肽. 進化樹分析表明, 三角褐指藻與海鏈藻DGAT1蛋白同源性最高. RT-qPCR結(jié)果表明, 光照強度和溫度均顯著促進三角褐指藻1基因的表達. 隨著光照強度和溫度的增加, 三角褐指藻1基因的表達量呈先升高后降低趨勢, 在光照強度為2500lx或溫度為25℃時, 三角褐指藻1基因的表達量達到最大, 這與三角褐指藻總脂含量的變化趨勢一致, 同樣揭示DGAT1蛋白與三角褐指藻總脂生物合成與積累密切相關(guān).

三角褐指藻;1基因; 克隆; 生物信息學(xué); 基因表達調(diào)控

二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(Diglyceride Acyltrans- ferase, DGAT)是三脂酰甘油(TAG)合成途徑中的唯一限速酶, 催化二脂酰甘油結(jié)合脂肪酸酰基形成TAG. 三角褐指藻()是海洋微藻中生長較快、脂質(zhì)含量較高的藻種[1], 其油脂含量約占細胞干重的20%～30%, 是一種可以用來制備生物柴油的微藻[2]. 三角褐指藻碳儲存的主要形式為油脂, 特別是三脂酰甘油(TAG). 甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(Glycerol-3-Phosphate Acyltrans- ferase, GPAT)催化3-磷酸甘油形成溶血磷脂酸, 隨后由1-?；视?3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(AGPAT)催化生成磷脂酸, 隨后在磷脂酸磷酸酶(Phospha-tidic Acid Phophyhydrolase, PAP)的催化下形成甘油二脂, 最后在二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(Diglyceride Acyltransferase, DGAT)的催化下生成TAG. DGAT是TAG合成途徑中的最后一步, 也是TAG合成途徑中的限速酶[3], 能調(diào)控脂肪代謝以及脂類在細胞中的沉積. 根據(jù)其結(jié)構(gòu)差異, DGAT有DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和胞質(zhì)內(nèi)DGAT (CytoDGAT)共4種類型[4]. DGAT1與DGAT2是普遍存在的2個亞型, DGAT1主要作用于TAG代謝, 而DGAT2則側(cè)重于積累特殊脂肪酸[5]. DGAT通過影響種子發(fā)育過程中TAG含量, 對種子質(zhì)量和脂肪酸組成成分起一定作用[6]. Jako等[6]發(fā)現(xiàn)將基因插入擬南芥染色體中, 能降低擬南芥種子中DGAT1活性, 從而減少TAG含量與油脂含量. Lardizabal等[7]將深黃傘形霉()2在大豆中超量表達后, 使其種子的含油量提高了1.5%. 研究表明, 在有利條件下微藻會積累大量脂質(zhì)[8], 三角褐指藻可以作為生產(chǎn)生物燃料的有效原料廣泛應(yīng)用[9]. 目前1基因已在玉米()[10]、大豆()[11]、棉花()[12]與油茶()[13]等陸地植物中克隆出來, 但未見從海洋藻類, 特別是三角褐指藻中有克隆1基因的報道. 鑒于三角褐指藻是目前油脂生產(chǎn)的理想海洋藻類, 從三角褐指藻中克隆1基因, 深入研究藻類油脂積累分子機制, 并采用代謝工程策略提高藻類油脂含量, 以期提供優(yōu)良基因資源, 為最終實現(xiàn)藻類的生物柴油生產(chǎn)提供前期的研究基礎(chǔ).

不同微藻藻種積累脂肪的能力不同, 但當(dāng)它們處于不利生長時, 微藻往往會合成大量的脂肪. 影響微藻脂類合成的因素有光照、溫度、pH、營養(yǎng)鹽等. 光照可促進陸地植物油脂的積累, 光反應(yīng)為質(zhì)體中脂肪酸的合成提供ATP和NADPH, 激活Rubisco旁路, 使得在油脂合成過程中能更有效地利用碳流[4]. 呂文兵等[14]發(fā)現(xiàn), 杜氏鹽藻()的葉綠體基因的表達量在光照強度4500lx時顯著升高, 但是過高的光強反而會抑制基因的表達. 溫度通常會影響油料種子的脂肪酸組成, 其原因是溫度影響了2基因和PEP羧化酶活性, 進而影響到油脂的合成[4]. 光照和溫度可調(diào)控陸地植物脂類合成, 在微藻研究中也有類似報道[15-16]. 但光照強度和溫度對微藻1基因的表達調(diào)控研究較少, 光照和溫度是否通過調(diào)節(jié)1基因進而表達來促進三角褐指藻脂類的含量, 目前還未見相關(guān)報道. 因此, 本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得三角褐指藻1基因cDNA全長序列, 通過研究三角褐指藻在不同光照強度和溫度下,1基因轉(zhuǎn)錄差異及其與脂質(zhì)含量之間的相關(guān)性, 以期為進一步研究三角褐指藻脂質(zhì)合成與積累的途徑、機制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 三角褐指藻培養(yǎng)與處理

三角褐指藻藻種由寧波大學(xué)海洋生物工程實驗室微藻種質(zhì)庫提供, 培養(yǎng)方法參照文獻[17]方法進行. 取高溫滅菌的過濾海水, 以1:1000比例加入MVA母液[18], 以1:3(藻種:海水)比例接藻. 培養(yǎng)溫度為(20±0.5)℃, 光暗周期比12h:12h, 每天搖瓶3次. 光照處理組的培養(yǎng)溫度為(20±0.5)℃, 光照強度為0、1000、2500、5000lx, 每個處理組設(shè)置3個平行. 溫度處理組的光照強度為1000lx, 溫度設(shè)置為15、20、25、30℃, 每個處理組設(shè)置3個平行. 培養(yǎng)至第7天時, 測定總脂含量.

1.2 三角褐指藻DGAT1基因的獲得與生物信息學(xué)分析

取處于對數(shù)生長期的三角褐指藻藻液, 用植物總RNA提取試劑盒(北京奧萊博生物技術(shù)有限公司)提取總RNA. 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, 大連)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA. 通過轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得三角褐指藻1基因cDNA全長序列, 設(shè)計擴增ORF的引物(F-DGAT: 5’-ATGTTGTGCC GGAAATACTTC-3’, R-DGAT: 5’-TCAACGAATC AAGCA GGA AT-3’)進行PCR驗證, PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后連接T載體, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a, PCR驗證后送公司測序.

使用Vector軟件對三角褐指藻和其他物種的DGAT1蛋白進行多序列的比對(表1)[19]. 通過ProtParam (http://eapasy.org/tools/protparam.html)在線工具對三角褐指藻DGAT1氨基酸序列進行分析, 預(yù)測其相對分子量、等電點等特性, 并用ExPASy預(yù)測DGAT1蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[20]. 利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對三角褐指藻DGAT1蛋白進行跨膜區(qū)域預(yù)測. 用Clustal_X 1.8和Mega 3.0軟件對DGAT1蛋白進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建.

表1 DGAT1氨基酸序列分析所用物種

1.3 三角褐指藻DGAT1基因的表達調(diào)控研究

對三角褐指藻光照處理組和溫度處理組培養(yǎng)24h, 然后分別提取總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄. 以三角褐指藻基因作為管家基因, 引物為-F (5’-CGTGACTTGACGGACTACCTG-3’)和- R(5’-TAGTTTTTGTCCAGAGCCGAG-3’). 三角褐指藻1基因的定量PCR引物為1-F(5’- GGTATGTTTGCGTAGACTTGT-3’)和1-R(5’- TCGTTATTTACTTCGGAGATT-3’), 由生工生物工程(上海)有限公司合成. 使用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa, 大連)進行熒光定量PCR. 熒光定量PCR反應(yīng)體系為SYBR?Premix Ex TaqTM(2×) 10μL, F-prime、R-primer(10μmol?L-1)各0.8μL, cDNA模板2μL, 超純水6.4μL. 每組樣品重復(fù)3次, 反應(yīng)程序: 94℃3min; 94℃ 30s, 53℃ 40s, 72℃ 20s, 40個循環(huán); 72℃延伸10min, 4℃保存. 三角褐指藻1基因相對轉(zhuǎn)錄水平用2-ΔΔCt方法計算, 使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析[21].

1.4 三角褐指藻總脂含量的測定

分別取光照處理組和溫度處理組培養(yǎng)7d的三角褐指藻30mL, 4℃, 5000r?min-1離心10min. 使用無菌水沖洗2～3次, 并在4℃, 8000r?min-1條件下離心10min. 總脂含量的測定采用改良的Bligh- Dyer法[22].

加粗下劃線標注為起始密碼子; 加粗下劃線下帶有“*”標注為終止密碼子; 下劃線標注部分為保守序列.

2 結(jié)果與分析

2.1 三角褐指藻DGAT1基因的生物信息學(xué)分析

通過三角褐指藻轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得了1基因的cDNA全長序列, 并經(jīng)過PCR測序驗證. 三角褐指藻1基因cDNA序列全長為1438bp, 開放閱讀框(ORF)為1098bp, 編碼365氨基酸序列(圖1).

蛋白質(zhì)多序列比對結(jié)果表明(圖2), 獲得的DGAT1蛋白序列屬于跨膜O-?；D(zhuǎn)移酶超家族(Membrane-Bound O-Acyltransferases Superfamily, MBOAT). 三角褐指藻DGAT1氨基酸序列含有脂肪酸蛋白特性(I)和DAG結(jié)合位點(II)結(jié)構(gòu)域, DGAT1具有ACC合成酶(ACC synthase)家族基因保守基團FYXDWWN.

I為脂肪酸蛋白特征; II為DAG結(jié)合位點.

2.2 三角褐指藻DGAT1蛋白質(zhì)基本理化分析

三角褐指藻DGAT1蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果表明, 三角褐指藻DGAT1蛋白由365個氨基酸組成, 總原子數(shù)為6054, 分子式C2018H3020N494O500S22, 相對分子質(zhì)量為42906.51, 等電點為8.77. DGAT1蛋白中亮氨酸(Leu)含量最高, 占總氨基酸的12.9%, 半胱氨酸(Cys)含量最少, 不含有吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec). 三角褐指藻DGAT1蛋白的正電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)為25, 負電荷殘基數(shù)(Arg+ Lys)為30, 不穩(wěn)定指數(shù)為37.97, 推測該蛋白為穩(wěn)定蛋白, 其脂肪指數(shù)為103.92.

三角褐指藻DGAT1蛋白的N端為親水區(qū), C端為疏水區(qū), 位于第264位的苯丙氨酸(Phe)有最強親水性, 最大值為2.867, 在約25～50、80～90、100～115、140～155、180～205、250～280和320～330位置AA處有7個親水峰. 其他區(qū)域則均以疏水性區(qū)域為主, 339位的Gly具有最強疏水性, 值為-2.34, 總平均親水系數(shù)為0.333, 推測DGAT1蛋白為親水性蛋白.

通過TMHMM-2.0軟件能夠推測三角褐指藻DGAT1蛋白存在6個跨膜結(jié)構(gòu)域, 其具體位置在13～35、39～61、134～153、186～208、259～281和314～336氨基酸處. 通過TMPRED推測, 三角褐指藻DGAT1蛋白可能含有7個強跨膜螺旋區(qū)域.

2.3 三角褐指藻DGAT1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明, 三角褐指藻DGAT1蛋白中α-螺旋所占區(qū)域比例最高, 約為41.37%, 延長鏈約占25.48%, 無規(guī)則卷曲也同樣約占25.48%, β-轉(zhuǎn)角所占比例最低, 約7.64%.

2.4 三角褐指藻DGAT1蛋白系統(tǒng)進化樹分析

相似性搜索及比對出17個物種18種DGAT1蛋白基因(圖3), 進化樹分為3個分支, 被子植物、藻類和動物各匯成分支, 三角褐指藻與海鏈藻的親緣關(guān)系最近, 匯成一支. 而小球藻與其他藻類生物同源性不高, 反而與被子植物間的親緣關(guān)系較近, 但也是植物中最原始的, 這與目前藻類在分類上將部分藻類劃歸植物, 而部分藻類劃歸為微生物的結(jié)果一致. 從進化樹結(jié)果表明, 三角褐指藻可劃入微生物類.

圖3 三角褐指藻與其他物種的DGAT1氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

2.4 光照強度和溫度對三角褐指藻總脂含量及DGAT1基因表達的影響

不同光照強度對三角褐指藻1基因的表達量和總脂含量結(jié)果表明(圖4(a)), 隨著光照強度的增強, 三角褐指藻1基因表達量不斷上升, 在光強為2500lx時,1基因表達量達到最大, 此后呈下降趨勢. 與此同時, 三角褐指藻總脂含量也與1基因表達量呈相同趨勢, 總脂含量隨光強增大而增加, 超過2500lx后總脂合成減少, 說明光照強度對三角褐指藻脂類合成的影響與1基因表達量相關(guān).

不同溫度對三角褐指藻總脂含量和1基因表達量的影響結(jié)果表明(圖4(b)), 25℃時的三角褐指藻1基因表達量和總脂含量均達到最大值, 30℃與其相比差異并不顯著. 而培養(yǎng)溫度低于20℃時, 三角褐指藻1基因表達量受到明顯抑制, 此時的總脂含量也減少明顯, 說明溫度對三角褐指藻脂類合成的影響與1基因的表達量相關(guān).

圖4 不同處理條件下的三角褐指藻DGAT1基因表達量和總脂含量

研究三角褐指藻總脂的含量與1基因表達量的關(guān)系, 可以發(fā)現(xiàn)三角褐指藻總脂含量與1基因表達量呈正相關(guān)性.1基因表達受抑制時, 總脂含量也隨之下降;1基因表達增加時, 總脂含量也相應(yīng)增多. 兩者具有高度的一致性, 表明DGAT1蛋白是三角褐指藻脂類合成和積累途徑中的關(guān)鍵酶基因之一.

3 討論

本文獲得的三角褐指藻DGAT1氨基酸N端序列包括脂肪酸蛋白特征和DAG結(jié)合位點, 該特征與油菜DGAT1蛋白結(jié)構(gòu)相類似[23]. 通過DGAT蛋白結(jié)構(gòu)特點與序列比對, 認為該基因?qū)儆贒GAT1. DGAT1蛋白一般含有6～9個跨膜區(qū)域[24], 蛋白較大, N端有親水域位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的胞質(zhì)面[25]. DGAT1具有ATACS保守基團FYXDWWN, 可能與?；o酶A的形成有關(guān)[26]. 三角褐指藻DGAT1氨基酸序列第215～221也為該基團, 且位于脂肪酸蛋白特征處. 人與動物DAGT1蛋白N端功能研究表明, 此段序列可能與acyl-CoA互相作用形成二聚體或四聚體[27].

從進化樹可看出, 三角褐指藻與海鏈藻的親緣關(guān)系較近, 與其他陸生植物、動物的親緣關(guān)系較遠. 郝敬云等[27]則發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻()2家族中的CreDGTT1-5與三角褐指藻有較近的關(guān)系. 而張曉瓊等[28]研究模式生物2基因進化樹時發(fā)現(xiàn), 藻類植物DGAT蛋白獨自形成進化分支, 并且與其他陸生植物的親緣關(guān)系較遠. 序列分析可以發(fā)現(xiàn)各個物種具有較高的多樣性[29], 但是基因家族動植物之間的同源關(guān)系及其起源仍然不夠清晰, 需要進行更加深入的探究.

在RT-qPCR結(jié)果中, 三角褐指藻1基因表達量和總脂含量對于光照和溫度的變化呈相類似的趨勢. 適當(dāng)加強光照、升高溫度可增加三角褐指藻1基因的表達量和總脂含量. 進一步研究發(fā)現(xiàn)1基因與三角褐指藻脂質(zhì)合成與積累呈正相關(guān), 說明1基因是脂類合成的關(guān)鍵酶基因. 尹航等[15]的研究結(jié)果也表明, 在一定溫度和光照強度處理下, 三角褐指藻基因的表達量與總脂含量呈顯著正相關(guān), 說明光照強度和溫度可通過促進三角褐指藻內(nèi)TAG生物合成途徑中的1和關(guān)鍵酶基因的表達, 增加關(guān)鍵酶活性, 進而加速藻內(nèi)脂類合成與代謝. 而在高溫和強光脅迫下, 不僅酶活性受到抑制, 藻細胞的生理活性也會遭到破壞, 導(dǎo)致細胞死亡. 沈城等[30]發(fā)現(xiàn)持續(xù)高溫脅迫使珊瑚共生蟲黃藻()基因的表達量隨著溫度的升高顯著增加. 華雪銘等[16]實驗發(fā)現(xiàn), 35℃下的綠色巴夫藻()全部死亡, 10℃時的藻細胞大量死亡, 而在最適溫度20℃下, 綠色巴夫藻生長最快, 合成脂質(zhì)最多. 周洪琪等[31]研究發(fā)現(xiàn), 不同藻類的最適溫度和光照不相同, 但總是在最適時有最大生長量和總脂含量. 以上結(jié)果表明, 適宜的光照和溫度能促進脂類生物合成, 除了與脂類生物合成途徑基因1和的表達有關(guān)以外, 還有可能通過基因的表達與光合作用有關(guān). 如果為了更深入地研究光照和溫度促進微藻脂類合成的分子機理, 還需要采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)、代謝組學(xué)技術(shù)等技術(shù)進行深入的研究.

4 結(jié)論

三角褐指藻1基因cDNA序列全長為1438bp, ORF為1098bp, 編碼365氨基酸序列, 含有脂肪酸蛋白特性(I)和DAG結(jié)合位點(II)等功能結(jié)構(gòu)域. 預(yù)測三角褐指藻DGAT1蛋白為親水性蛋白, 含有6個跨膜結(jié)構(gòu)域和7個超強跨膜螺旋區(qū), 無信號肽. 三角褐指藻與海鏈藻同屬于藻類聚類為同一支. 光照強度和溫度處理均顯著促進三角褐指藻1基因的表達, 在光照強度為2500lx或溫度為25℃時, 三角褐指藻1基因的表達量達到最大, 這與三角褐指藻總脂含量的變化趨勢一致, 暗示DGAT1蛋白可能與三角褐指藻總脂生物合成與積累密切相關(guān), 是總脂合成途徑的關(guān)鍵酶之一.

[1] Gouveis L, liveira A C. Microalgae as a raw material for biofuels production[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2009, 36(2):269-274.

[2] Chisti Y. Biodiesel from microalgae[J]. Biotechnology Advances, 2007, 25(3):294-306.

[3] 馬海明, 施啟順, 柳小春. DGAT相關(guān)基因研究進展[J]. 遺傳學(xué)報, 2005, 32(12):1327-1332.

[4] 唐桂英, 柳展基, 單雷. 二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)研究進展[J]. 中國油料作物學(xué)報, 2010, 32(2):320-328.

[5] Shockey J M, Gidda S K, Chapital D C, et al. Tung tree DGAT1 and DGAT2 have nonredundant functions in triacylglycerol biosynthesis and are localized to different subdomains of the[J]. Plant Cell, 2006, 18(9):2294-2313.

[6] Jako C, Taylor D C. Seed-specific over-expression of an Arabidopsis cDNA encoding a diacylglycerol acyltrans- ferase enhances seed oil content and seed weight[J]. Plant Physiology, 2001, 126(2):861-874.

[7] Lardizabal K, Effertz R, Levering C,et al. Expression ofDGAT2A in seed increases oil in soybean[J]. Plant Physiology, 2008, 148(1):89-96.

[8] Gómez-Loredo A, Benavides J, Rito-Palomares M. Growth kinetics and fucoxanthin production of, and, cultures at different light and agitation conditions[J]. Journal of Applied Phycology, 2016, 28(2):849-860.

[9] Jaeyon L, Chan Y, Soyoung J, et al. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae[J]. Bioresource Technology, 2009, 101(1):75- 77.

[10] 李書霞, 劉偉, 李威, 等. 玉米DGAT基因家族的全基因組分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報, 2015, 29(4):643-650.

[11] 劉貴芹, 邵群, 黃榮峰, 等. 大豆DGAT基因家族的鑒定和表達分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2013, 29(12):55-61.

[12] 李書霞. 玉米和棉花DGAT基因家族的全基因組分析[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2015.

[13] 劉凱. 油茶DGAT1基因的全長cDNA克隆與原核表達[D]. 長沙: 中南林業(yè)科技大學(xué), 2012.

[14] 呂文兵, 劉紅濤, 薛樂勛. 不同鹽濃度和光照強度對杜氏鹽藻基因表達的影響[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010, 44(2):288-292.

[15] 尹航, 袁嵐瑛, 俞凱, 等. 三角褐指藻基因生物信息學(xué)及表達差異分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報, 2019, 33(8): 1483-1489.

[16] 華雪銘, 周洪琪, 丁卓平. 溫度和光照對微藻的生長、總脂肪含量及脂肪酸組成的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 1999, 8(4):309-315.

[17] 葉麗, 蔣霞敏, 毛欣欣, 等. 溫、光、鹽對三角褐指藻紫外誘變株生長、總脂及脂肪酸的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2015, 34(2):454-462.

[18] 蔣霞敏, 鄭亦周. 14種微藻總脂含量和脂肪酸組成研究[J]. 水生生物學(xué)報, 2003, 27(3):243-247.

[19] 呂軍, 張穎, 馮立芹, 等. 生物信息學(xué)工具BLAST的使用簡介[J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2003, 34 (2):179-191.

[20] Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server[M]//The Proteomics Protocols Handbook. Totowa, NJ: Humana Press, 2005:571-607.

[21] 余舜武, 劉鴻艷, 羅利軍. 利用不同實時定量PCR方法分析相對基因表達差異[J]. 作物學(xué)報, 2007, 33(7): 1214-1218.

[22] Bligh E G, Dyer W J. A rapid method of total lipid extraction and purification[J]. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology, 1959, 37(8):911-917.

[23] 馬燕斌, 吳霞, 王霞, 等. 甘藍型油菜基因表達的特異性分析[J]. 西北植物學(xué)報, 2013, 33(10): 1958-1963.

[24] 周丹. 大豆二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)基因克隆及其功能的初步研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[25] Lung S C, Weselake R J. Diacylglycerol acyltransferase: A key mediator of plant triacylglycerol synthesis[J]. Lipids, 2006, 41(12):1073-1088.

[26] Guo Z, Cromley D, Billheimer J T, et al. Identification of potential substrate-binding sites in yeast and human acyl- CoA sterol acyltransferases by mutagenesis of conserved sequences[J]. Journal of Lipid Research, 2001, 42(8): 1282-1291.

[27] Weselake R J, Madhavji M, Szarka S J, et al. Acyl-CoA- binding and self-associating properties of a recombinant 13.3 kDa N-terminal fragment of diacylglycerol acyl- transferase-1 from oilseed rape[J]. BMC Biochemistry, 2006, 7(1):24-36.

[28] 郝敬云, 周廣航, 邵雪梅, 等. 萊茵衣藻基因家族的鑒定與功能分析[J]. 分子植物育種, 2016, 14(9): 2343-2352.

[29] 張曉瓊, 喬琳, 胡利宗, 等. 棉花與模式植物基因的鑒定與分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 44(10):69- 73.

[30] 沈城, 劉楚吾, 劉麗. 溫度脅迫及恢復(fù)初期稀杯盔形珊瑚共生蟲黃藻、、、基因表達分析[J]. 熱帶海洋學(xué)報, 2016, 35(3):72-78.

[31] 周洪琪, Renaud S M, Pany D L, 等. 溫度對新月菱形藻、鏟狀菱形藻和杷夫藻的生長、總脂肪含量以及脂肪酸組成的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 1996, 20(3):235-240.

Bioinformation analysis and expression regulation of1 gene in

WANG Heyu1, GONG Yifu2,3*, ZHENG Xiaoyun2,3, LI Shenrui2,3

( 1.College of Food and Pharmaceutical Sciences, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 2.School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 3.Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province, Ningbo 315832, China )

In the current study, the full-length cDNA sequence of1 (GeneBank Accession Number: 7200924) inwas cloned by transcriptome sequencing. Bioinformatics analysis and expression difference were also studied. The results showed that the full length of the1 gene fromwas 1438bp, had an open reading frame (ORF) of 1098bp with the fatty acid-binding protein signature (I) and DAG binding site (II) domains, encoding 365 amino acids. The protein prediction results showed that the DGAT1 protein fromwas a hydrophilicity protein including 6 transmembrane structure domains and 7 super transmembrane helical regions, without signal peptide. Phylogenetic analysis results showed that DGAT1 protein fromhad closed homologous relationship with the DGAT1 protein of. RT-qPCR results showed that light intensity and temperature could significantly promote the expression of1 gene ofWith the increase of light intensity and temperature, the expression quantity of1 gene fromshowed an increased first and then decreased trend. The expression quantity of1 gene reached the maximum at light intensity of 2500 lx or temperature of 25℃. The expression of1 gene was consistent with the total fat content. The results indicated that DGAT1 protein might be one of the key enzymes in the biosynthesis and accumulation of total lipid in.

;1gene; cloning; bioinformatics; gene expression regulation

S917.3; Q943.2

A

1001-5132（2021）04-0001-07

2019?11?20.

寧波大學(xué)學(xué)報（理工版）網(wǎng)址: http://journallg.nbu.edu.cn/

浙江省科技廳重點科技創(chuàng)新團隊項目（2012R10029-07, 2010R50029）; 寧波市科技攻關(guān)項目（2014C91023, 2013C10018）; 寧波市社發(fā)重大項目（2017C510002）.

王何瑜（1982－）, 女, 重慶江津人, 助理實驗師, 主要研究方向: 藻類生物技術(shù). E-mail: wangheyu@nbu.edu.cn

龔一富（1973－）, 男, 重慶開縣人, 博士/副教授, 主要研究方向: 植物次生代謝產(chǎn)物及機理. E-mail: gongyifu@163.com

（責(zé)任編輯 章踐立）