高效液相色譜法測定甘草流浸膏中赭曲霉毒素A的含量

歐陽吉德 鄧湘波 康樂 劉冠瓊

郴州市食品藥品檢驗檢測中心，湖南 423000

赭曲霉毒素A是赭曲霉毒素家族中最重要的毒素，由多種曲霉菌（赭曲霉）和青霉菌（疣孢青霉）產(chǎn)生。赭曲霉毒素普遍存在于熱帶和氣候溫和的地區(qū)，污染范圍廣，常出現(xiàn)在燕麥、大麥、小麥和玉米農(nóng)作物上，導(dǎo)致赭曲霉毒素A廣泛分布于各種谷物和中藥材中，從而侵害動物及人體肝臟與腎臟［1-3］。

甘草流浸膏主要用于止咳、化痰，適用于感冒、咳嗽、多痰、支氣管性氣喘等。赭曲霉毒素在甘草流浸膏質(zhì)量安全有著重要的關(guān)聯(lián)性，在國家大力推動中藥材標準化建設(shè)的形勢下，從源頭上加強中藥材質(zhì)量安全控制，系統(tǒng)研究中藥材毒素存量情況很有必要，研究甘草流浸膏中赭曲霉毒素是判斷該藥品質(zhì)量合格與否的重要指標。目前針對赭曲霉毒素的檢測方法主要集中于谷物、大豆、小麥等糧食制品，方法主要有液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、薄層色譜法［2-6］，然而此類方法均存在設(shè)備昂貴、操作過程繁瑣、試劑耗費大、靈敏度低等特點。免疫親和層析凈化與高效液相色譜法相結(jié)合的方法，較好地克服了以上缺點，具有快速高效、操作簡便等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于食品等領(lǐng)域。但中國藥典中尚未建立甘草流浸膏中赭曲霉毒素相關(guān)檢驗檢測方法［7］，免疫親和層析凈化液相色譜法用于中藥材中赭曲霉毒素測定的研究也罕見于報道［8-10］。

本文首次采用免疫親和層析凈化-高效液相色譜法對甘草流浸膏中赭曲霉毒素A進行分析測定。以Hypersil BDC-C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm）為分析柱，以乙腈為流動相A，以2%冰乙酸溶液為流動相B，按梯度洗脫程序，激發(fā)波長（Ex）=333 nm，發(fā)射波長（Em）=460 nm，流速1.0 ml/min，柱溫35℃，進樣量10μl，對赭曲霉毒素A的測定。建立了1種測定甘草流浸膏中赭曲霉毒素A的簡便、快速的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀，包括CBM-20A系統(tǒng)控制器、DGU-20As真空脫氣機、LC-20AT溶液傳輸單元、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、RF-20A熒光檢測器、LCsolution工作站（日本Shimadzu公司）；免疫層析凈化系統(tǒng)；METTLER TOLEDO ML204電子分析天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）；0.1～1.0 ml可調(diào)移液槍（德國艾本德有限公司）；PriboFast赭曲霉毒素A免疫親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司，2～8℃）。

1.2 試藥 赭曲霉毒素A對照品（青島普瑞邦生物工程有限公司，批號：1I00H06，濃度：100.3μg/ml）；甘草流浸膏由南開制藥有限公司提供。試驗用水為自制超純水：SMART2 PURE智能一體化超純水系統(tǒng)（美國賽默飛世爾科技公司）制備。其他試劑：甲醇（色譜純）、冰乙酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀均采購于國藥集團。磷酸緩沖溶液：稱取8.00 g氯化鈉，1.20 g磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀，用990 ml蒸餾水溶解，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后用蒸餾水稀釋定容至1 000 ml。甲醇-水（80∶20）提取液：移取800 ml甲醇，加蒸餾水200 ml混合。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品凈化

2.1.1 樣品取樣 將樣品混合均勻，精密稱?。ň_到0.1 g）5.0 g至均質(zhì)器中，加提取液甲醇-水（80∶20）溶液混勻，定容至50 ml容量瓶中，渦旋混勻并超聲提取5 min。移取10 ml濾液于50 ml容量瓶中，用水定容至刻度，混勻；用玻璃纖維濾紙過濾至澄清，取濾液備用。

2.1.2 樣品凈化 將低溫下的免疫親和柱提前恢復(fù)至室溫。將泵流操作架的注射器下端用力插穿免疫親和柱上蓋中間圓孔，使其連通；準確移取10 ml樣品提取液轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi)，打開下端堵頭；將空氣壓力泵與注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使樣品提取液緩慢通過免疫親和柱，建議重力過柱；先用10 ml PBS加壓清洗1次，再用10 ml蒸餾水加壓清洗1次，棄去全部流出液，并使2～3 ml空氣通過柱體。

2.1.3 樣品洗脫 首先將免疫親和柱內(nèi)液體排干，下端蓋上堵頭，加1.0 ml洗脫液（色譜甲醇∶乙酸=98∶2）洗脫液于柱管內(nèi)孵育60 s以上，重力過柱，當(dāng)溶劑通過柱子后，再加入1.0 ml洗脫液重復(fù)上述洗脫步驟，最后輕微加壓排凈洗脫液，合并洗脫液，將洗脫液在45℃下氮氣吹干，用1.0 ml流動相溶解，既得樣品待測溶液。同時制備空白溶液。將樣品溶液和空白溶液注入高效液相色譜儀中，按照繪制校準曲線相同的儀器工作條件進行測定。

2.2 色譜條件 對赭曲霉毒素A的測定采用Hypersil BDC-C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈-2%冰醋酸（48∶52），Ex=333μm，Em=460μm，流速1.0 ml/min，柱溫35℃，進樣量10μl。分別配制對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

圖1 赭曲霉毒素A的高效液相色譜法圖（A為標準品，B為供試品，C為陰性樣品）

2.3 線性關(guān)系考察 將赭曲霉毒素A標準品用色譜純甲醇充分溶解，配制成1 000.0μg/ml標準溶液。定量移取標準溶液于10.0 ml容量瓶中，分別配制成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/ml標準工作液，通過0.22μm微孔濾膜，上機測定。重復(fù)測定2次，結(jié)果取平均值，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程Y=221.23X+170.72，r=0.998 7。

2.4 回收率試驗 精密稱取3份甘草流浸膏樣品5.0 g，按上述2.1實驗方法凈化，以2.2梯度洗脫方法對樣品中赭曲霉毒素A測定，每份樣品平行測定2次，取其平均值，得到甘草流浸膏樣品中赭曲霉毒素A本底結(jié)果。再另外精密稱取同批次甘草流浸膏樣品3份（每份約5.0 g），分別加入5.0μg、10.0μg、25.0μg赭曲霉毒素A標準溶液，按照前述試驗方法進行凈化、測定。經(jīng)計算，樣品中赭曲霉毒素加樣回收率分別為90.10%、94.85%、92.48%，平均回收率為92.48%，相對標準差為2.57%，結(jié)果表明回收率良好，平均回收率為92.48%。

3 討 論

3.1 樣品處理條件的選擇 稱取樣品時應(yīng)注意，真菌毒素分析的最大誤差來源是樣品的收集和取樣過程，所以要保證樣品收集和取樣的均勻性和代表性。

為了樣品凈化過程對測定結(jié)果的影響，課題組研究了甲醇-水提取液的比例，試驗結(jié)果表明，甲醇-水（80∶20）體系較優(yōu)；洗滌時洗滌液既可以用蒸餾水也可以用PBS，但考慮到在洗脫前更好地防止親和柱中單克隆抗體變性，使用PBS清洗液更好；由于糖漿劑含糖量在75.00%以上，基質(zhì)效應(yīng)復(fù)雜。含糖量嚴重影響免疫親和柱的柱容，從而對樣品回收率產(chǎn)生較大的影響。課題組進一步研究了該赭曲霉毒素A免疫親和柱，將不同濃度的標準工作液1.0 ml分別通過免疫親和柱，保持壓力穩(wěn)定，將流速控制為1滴/s，凈化過程同樣品處理，收集洗脫液測定。結(jié)果表明當(dāng)樣品量小于5 g，加標濃度小于100.0μg時，回收率較為穩(wěn)定。

3.2 色譜檢測條件優(yōu)化 由于甘草流浸膏含糖量高，內(nèi)容物成分復(fù)雜、雜質(zhì)多，易造成樣品背景高、分離度差等情況。試驗針對色譜條件，分別對等度洗脫及梯度洗脫兩方面進行了優(yōu)化研究。試驗將等度洗脫程序：色譜柱柱溫設(shè)定為35℃，流速1.0 ml/min，以48%乙腈（A）-52%冰乙酸（2%）水溶液（B）為流動相，Ex=333μm，Em=460μm，進樣量10.0μl。梯度洗脫程序：色譜柱柱溫設(shè)定為35℃，流速1.0 ml/min，以乙腈為流動相A，以2%冰乙酸溶液為流動相B，按梯度洗脫條件，Ex=333μm，Em=460μm，進樣量10.0μl。兩者進行對比，結(jié)果顯示，梯度洗脫程序能夠較好地分離樣品中各成分，并得到較低的本底。

綜上所述，甘草流浸膏是我國常用的止咳化痰處方藥，在全國應(yīng)用市場非常廣泛。本研究選取甘草流浸膏作為研究對象，試驗方法通過一系列預(yù)處理方法的優(yōu)化和方法驗證，排除了基質(zhì)干擾，建立了測定甘草流浸膏中赭曲霉毒素A的免疫親和層析凈化高效液相色譜分析方法。采用的處理方法簡單、可靠，該方法線性關(guān)系、精密度、回收率良好，可適用于甘草流浸膏等中成藥測定赭曲霉毒素A，為甘草流浸膏的安全性質(zhì)量控制檢查提供了方法依據(jù)。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。