1例結(jié)石患犬尿液中犬種布魯氏菌的分離與鑒定

黃 薇 ， 蔣 卉 ， 馮 宇 ， 肖 盟 ， 繳 瑩 ， 劉 洋 ， 季玲西 , 呂艷麗，4

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動物醫(yī)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國家/OIE布魯氏菌病參考實驗室 ， 北京 大興 102600 ； 3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科 侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點實驗室 ， 北京 東城 100730 ； 4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

犬布魯氏菌病(以下簡稱犬布病)是由布魯氏菌感染引起的人獸共患病。引起犬布病的細(xì)菌主要是犬種布魯氏菌(B.canis)，有時羊種(B.melitensis)、牛種(B.abortus)和豬種(B.suis)布魯氏菌也可導(dǎo)致犬布病。除了不孕癥、母犬流產(chǎn)、公犬睪丸炎和附睪炎等生殖系統(tǒng)疾病外，犬種布魯氏菌還可引起犬的無癥狀感染和淋巴結(jié)病、脾臟腫大及葡萄膜炎、椎間盤炎等多種臨床病癥。由于犬種布魯氏菌對人的致病力較牛種、羊種和豬種布魯氏菌弱，世界衛(wèi)生組織(WHO)和世界動物衛(wèi)生組織(OIE)都沒有將犬種布魯氏菌列入法定報告的人獸共患病病種，但國內(nèi)外關(guān)于犬種布魯氏菌感染人的情況時有報道[1-3]，且人類實際感染數(shù)量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于確診病例的數(shù)量[4-5]。文獻(xiàn)報道犬可以通過尿液向外界排菌，但通過尿液向外界排菌所造成危害的嚴(yán)重程度鮮有人關(guān)注。本文通過對1例膀胱結(jié)石患犬尿液中的犬種布魯氏菌的分離鑒定過程進(jìn)行描述，以期引起寵物診療人員和飼養(yǎng)、繁殖相關(guān)人員對犬種布魯氏菌病的高度重視，為防控人間犬種布魯氏菌病的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

1 患犬基本信息

博美犬，7歲，雄性，體重4.02 kg，因尿閉在外院導(dǎo)尿失敗而轉(zhuǎn)至中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動物醫(yī)院。在外院就診時經(jīng)超聲引導(dǎo)穿刺排放尿液2次。體格檢查發(fā)現(xiàn)，患犬左側(cè)皮下隱睪，其他未見明顯異常。泌尿系統(tǒng)B超檢查結(jié)果提示，患犬膀胱內(nèi)和前列腺段尿道結(jié)石。血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞總數(shù)升高至19.06×109/L(正常范圍：5.05×109～16.76×109/L)，葉狀中性粒細(xì)胞升高至14.29×109/L(正常范圍：2.95×109～11.64×109/L)，伴桿狀中性粒細(xì)胞增高至1.14×109/L(正常范圍：0～0.3×109/L)，提示急性炎癥。血清生化檢查未見明顯異常。尿液檢查發(fā)現(xiàn)，患犬尿液pH為7.5，輕度偏堿性。對患犬行膀胱切開手術(shù)取出結(jié)石并同時實施了去勢手術(shù)。對術(shù)中取出的結(jié)石采用布魯克結(jié)石紅外分析儀(布魯克北京科技有限公司)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示結(jié)石成分為95%鳥糞石和5%磷酸鈣。

2 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定

分別將術(shù)中采集的尿液和膀胱黏膜，術(shù)后第14天和第60天膀胱穿刺采集的尿液樣本及術(shù)后第60天采集的血液樣本進(jìn)行了細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定。

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將術(shù)中采集的尿液和膀胱黏膜，分別接種到血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上于37 ℃條件下培養(yǎng)。接種后24 h，2種培養(yǎng)基上均未見細(xì)菌生長；繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，可見接種尿液的血瓊脂培養(yǎng)基上有針尖大細(xì)菌菌落生長；繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，可見血瓊脂平板上生長出直徑約0.5 mm、半透明、圓形隆起、表面濕潤、邊緣規(guī)則的菌落，數(shù)量為5×102CFU/mL。取單個菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，鏡下可見菌體呈革蘭染色陰性、短桿狀、球形或球桿狀細(xì)菌(中插彩版圖1)。膀胱黏膜37 ℃需氧培養(yǎng)72 h，未見細(xì)菌生長。

圖1 犬種布魯氏菌鏡下形態(tài) (革蘭染色，1 000×)

2.2 細(xì)菌飛行質(zhì)譜鑒定和16S rDNA PCR擴(kuò)增與序列分析 將分離獲得的菌株經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS，飛行質(zhì)譜)技術(shù)分析，與綿羊附睪種布魯氏菌(Brucellaovis)最為相似，分值為9.159。將分離菌株進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增和序列分析，布魯氏菌核苷酸序列同源性最高為99.7%。

2.3 布魯氏菌Bruce-Ladder PCR鑒定 參照GB/T 18648-2018 《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》[6]合成8對PCR序列引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，對分離菌株進(jìn)行Bruce-Ladder PCR分子鑒定，反應(yīng)體系：10× PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs (2.0 mmol/L)5.0 μL，Mg2+(50 mmol/L) 1.5 μL，8對 引物混合液(12.5 μmol /L)7.6 μL，TaqDNA聚合酶 0.3 μL，DNA模板(0.1 μg/μL)1 μL，超純水7.1 μL，共25 μL。擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃變性35 s，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，共計25個循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像分析，結(jié)果顯示，分離菌株為犬種布魯氏菌(圖2)。

圖2 分離菌株的Bruce-Ladder PCR擴(kuò)增M：DL-5 000 DNA marker； 1：患犬分離菌株； -：陰性對照； +：犬種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株RM6/6

2.4 分別于術(shù)后第14天和第60天再次穿刺采集尿液進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定及菌落計數(shù)，分離獲得的細(xì)菌仍為犬種布魯氏菌，菌落計數(shù)分別為4×103CFU/mL和1×105CFU/mL。術(shù)后第60天同時采集了患犬抗凝血進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)72 h，未見細(xì)菌生長。

2.5 布魯氏菌血清學(xué)檢測 初次分離的細(xì)菌經(jīng)MALDI-TOF-MS技術(shù)分析初步鑒定為綿羊附睪種布魯氏菌后，采集患犬血清進(jìn)行布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(抗原由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家動物布魯氏菌病參考實驗室制備)，結(jié)果顯示，犬種布魯氏菌凝集試驗陽性(+)，光滑型布魯氏菌凝集反應(yīng)陰性(-)。采用膠體金凝集試紙條對血清樣本進(jìn)行驗證，結(jié)果與虎紅平板凝集試驗一致，即犬種布魯氏菌陽性(+)(韓國安捷動物診斷試劑有限公司)，光滑型布魯氏菌陰性(-)(上?？祆`生物科技有限公司)。

3 討論

患犬因膀胱結(jié)石引起的尿閉前來就診，在常規(guī)導(dǎo)尿失敗后對患犬實施了膀胱切開取石手術(shù)，并針對患犬的隱睪問題，進(jìn)行了公犬去勢術(shù)。手術(shù)同時，按照中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動物醫(yī)院常規(guī)流程對患犬尿液進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)，分離菌株經(jīng)系列鑒定后確定為犬種布魯氏菌。從結(jié)石患犬的尿液中分離出犬種布魯氏菌尚未見報道。本試驗同時發(fā)現(xiàn)，術(shù)后患犬尿液中的布魯氏菌含量呈上升趨勢，該生長趨勢有待于進(jìn)一步探討，尿液排放至環(huán)境所導(dǎo)致的環(huán)境污染以及所造成的危害應(yīng)引起高度重視。

3.1 犬種布魯氏菌的分離培養(yǎng)與鑒定 除了膀胱和尿道結(jié)石外，患犬術(shù)前未表現(xiàn)出睪丸炎、關(guān)節(jié)炎和椎間盤炎等犬種布魯氏菌感染的常見臨床癥狀。布魯氏菌為營養(yǎng)要求苛刻的需氧菌，通常48 h內(nèi)罕見形成菌落，一般需要培養(yǎng)5～10 d甚至20～30 d[7]。本分離菌株的生長速度較快，故初次分離出的細(xì)菌在進(jìn)行鑒定之前并未考慮其為布魯氏菌的可能性。隨后的MALDI-TOF-MS技術(shù)分析結(jié)果提示，分離菌株與綿羊附睪種布魯氏菌最為相似，獲得該鑒定結(jié)果的原因為綿羊附睪布魯氏菌與犬種布魯氏菌同為粗糙型布魯氏菌，有相似的脂多糖(LPS)結(jié)構(gòu)，但該數(shù)據(jù)庫中未包含犬種布魯氏菌數(shù)據(jù)，因此該結(jié)果一方面為后續(xù)鑒定指明了方向，同時豐富了質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫資料。同樣，16S rDNA序列分析結(jié)果也未將犬種布魯氏菌與其他種布魯氏菌鑒別開來，因為16S rDNA 在布魯氏菌的不同種間差異很小[8]。基于布魯氏菌的人獸共患危害性，在獲得質(zhì)譜鑒定結(jié)果后，采集了患犬血清進(jìn)行了血清學(xué)試驗，分離菌株經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家布魯氏菌參考實驗室進(jìn)行的Bruce-Ladder PCR鑒別診斷，最終確定為犬種布魯氏菌。

3.2 膀胱結(jié)石與犬種布魯氏菌的相關(guān)性 鳥糞石又叫磷酸銨鎂結(jié)石，幾乎95%的犬鳥糞石都是由脲酶陽性細(xì)菌感染引起的。產(chǎn)脲酶的細(xì)菌可將尿中的尿素水解成氨和二氧化碳，提高了尿液的pH，使銨離子可以形成磷酸銨鎂晶體[9]。犬種布魯氏菌是產(chǎn)脲酶細(xì)菌之一，該患犬尿液pH 7.5，并且穿刺獲得的尿液中僅培養(yǎng)出了犬種布魯氏菌。由此推測患犬膀胱中的鳥糞石形成與犬種布魯氏菌感染密切相關(guān)。

3.3 犬種布魯氏菌與公共衛(wèi)生安全 在布魯氏菌感染病例中，通常具有流產(chǎn)、睪丸炎、附睪炎癥狀的病犬容易引起人們的關(guān)注和高度重視，但無癥狀或癥狀不典型的帶菌犬容易被人忽視。本病例先后3次從膀胱穿刺采集的尿液中分離出了犬種布魯氏菌，且菌落計數(shù)數(shù)量呈遞增趨勢。這對于試圖通過對患犬實施絕育和去勢手術(shù)以降低犬種布魯氏菌傳播風(fēng)險[7]的愿景是一種挑戰(zhàn)。該分離結(jié)果源于布魯氏菌間歇排毒所致還是疾病發(fā)展不同階段所致，有待進(jìn)一步研究。值得注意的是，排尿引起了犬種布魯氏菌對環(huán)境的污染，這種危害的嚴(yán)重性將遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于犬種布魯氏菌感染生殖系統(tǒng)所致的風(fēng)險，具有重要公共衛(wèi)生意義，應(yīng)引起寵物醫(yī)生、犬舍、流浪犬收容所和寵物主人，尤其是公共衛(wèi)生主管部門的高度重視。盡管犬種布魯氏菌對人的致病力較弱，但作為一種人獸共患病，已有引起人類的敗血癥、心內(nèi)膜炎[7]等疾病的報道。