蔓荊子治療肝癌的潛在作用機制研究*

卜鑫玨，孫 梅，羅則華

(重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院/捷爾醫(yī)院，重慶 401120)

蔓荊子(Viticis Fructus)又名蔓荊實、荊子、萬荊子、蔓青子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂“蔓荊實，味苦，微寒。主筋骨間寒熱，濕痹拘攣。明目堅齒，利九竅，去白蟲。久服輕身，耐老”[1]。蔓荊子是辛涼解表常用中藥，善于清利頭面諸竅，主要產(chǎn)地為我國東南地區(qū)[2-3]。截至目前，國內(nèi)外專家對蔓荊子的活性成分及藥理作用進行了一系列系統(tǒng)研究，蔓荊子的有效成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫應答等作用[4-7]。

肝癌是全球第六大常見侵襲性癌癥，也是癌癥致死的第三大誘因[8]。亞洲是世界肝癌患者數(shù)最高的地區(qū)之一，其中中國占世界肝癌人數(shù)的50%以上[9]。肝癌的誘發(fā)因素很多，包括肝炎病毒感染、酒精性肝損傷、非酒精性脂肪肝疾病、肥胖、糖尿病等。關(guān)于蔓荊子及其有效成分可治療肝癌的研究較多，但其作用的分子機制尚不明確[10-11]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對其潛在的作用靶點、活性成分及相關(guān)通路進行分析，為進一步研究蔓荊子治療肝癌的藥理作用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1蔓荊子活性成分與靶點的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)輸入“Viticis Fructus”檢索蔓荊子的化學成分。按照ADME原則結(jié)合檢索結(jié)果，評價藥物化學成分在體內(nèi)的過程，將篩選條件設(shè)定為生物利用度(OB)大于30%，類藥性(DL)大于0.18，從而獲得蔓荊子的活性成分?；钚猿煞謱臐撛谧饔冒悬c通過TCMSP的檢索功能獲得，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行轉(zhuǎn)化，得到靶點名稱對應的基因符號。

1.1.2肝癌靶點的篩選 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞，檢索得到與肝癌相關(guān)的作用靶基因。

1.2方法

1.2.1藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用R軟件繪制韋恩圖，取蔓荊子活性成分靶點及肝癌靶點交集，得到蔓荊子抗肝癌的潛在作用靶點。利用Cytoscape3.6.1軟件對獲取的靶基因和活性成分進行可視化處理，從而構(gòu)建藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用String數(shù)據(jù)庫，輸入蔓荊子的蛋白靶點，選擇交互作用大于0.4，限定物種為智人(Homo sapiens)，去除游離節(jié)點，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。并利用R軟件輸出可視化柱狀圖，得到核心靶點。

1.2.3GO功能和KEGG信號通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對蔓荊子治療肝癌的預測靶基因進行GO功能和KEGG信號通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1蔓荊子活性成分及其作用靶點 共篩選到蔓荊子活性成分27種，對應靶點103個，同時篩選到與肝癌相關(guān)的靶點5 255個，取交集后共得到潛在作用靶點88個。見表1、2。

表1 蔓荊子治療肝癌的關(guān)鍵靶點

續(xù)表1 蔓荊子治療肝癌的關(guān)鍵靶點

表2 蔓荊子的關(guān)鍵化合物

2.2藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 蔓荊子治療肝癌具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特性。27種活性成分中，槲皮素、山柰酚、木樨草素3種活性成分作用靶點較多，分別作用70、28、27個靶點。88個作用靶點中，NCOA2、NCOA1、PGR 3個靶點對應活性成分較多，分別對應18、12、11個活性成分。

2.3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 蔓荊子治療肝癌的潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)中共包含88個節(jié)點，897條邊，不同靶點對應的“邊數(shù)”見圖1。IL6、CASP3、VEGFA、MAPK8、MYC、ESR1等靶點位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，在蔓荊子抗肝癌的機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖1 靶點對應的邊數(shù)

2.4GO功能和KEGG信號通路富集分析結(jié)果 利用DAVID平臺進行GO功能富集分析，共得到GO條目334條，其中生物過程230條，分子功能72條和細胞組分32條。按照P<0.5的閾值過濾，KEGG信號通路富集分析共得到76條通路。蔓荊子治療肝癌的靶點在生物過程方面，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細胞對過氧化氫的反應、凋亡過程的負調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、細胞對缺氧的反應、對乙醇的反應等生物過程。細胞組分方面涉及胞質(zhì)、核質(zhì)、細胞質(zhì)、細胞外空間、膜筏、線粒體等。分子功能方面涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、同源蛋白質(zhì)的結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類固醇結(jié)合、特異性DNA序列結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、類固醇激素受體活性等。由KEGG信號通路富集分析可知，蔓荊子治療肝癌的靶點主要涉及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、腫瘤壞死因子(TNF)、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞型(FoxO)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、細胞周期、MAPK、HIF-1、P53、VEGF、NOD樣受體等信號通路。

3 討 論

本研究基于疾病-基因-靶點-藥物的研究思路，應用網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)，從分子角度系統(tǒng)闡述蔓荊子治療肝癌的潛在作用機制。本研究結(jié)果顯示，蔓荊子有效活性成分有27個，治療肝癌的作用靶點有88個，其中槲皮素(70個)、山柰酚(28個)、木樨草素(27個)活性成分作用靶點較多；NCOA2(18個)、NCOA1(12個)靶點對應活性成分較多。這些可能是蔓荊子治療肝癌的關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵作用靶點。多個研究表明，槲皮素、山柰酚、木樨草素均有抗肝癌的作用，其中對應靶點最多的是槲皮素，其可通過調(diào)控脂質(zhì)，活化線粒體，增加細胞抗氧化和胰島素敏感性，從而發(fā)揮保護肝細胞的作用；山柰酚可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和CHOP自噬信號通路誘導肝癌細胞死亡；木樨草素可顯著誘導細胞周期在G0/G1期停滯，通過自噬誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡[12-16]。

GO功能富集分析顯示，蔓荊子治療肝癌生物過程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細胞對過氧化氫的反應等生物過程。RNA干擾是一種高效、特異沉默靶基因的新技術(shù)[17]，張良鵬[18]研究發(fā)現(xiàn)，RNA聚合酶Ⅱ重組hAFP和hTERT雙啟動子調(diào)控siRNA，可特異性抑制肝癌細胞mRNA表達及生長。過氧化氫是一種很強的氧化劑，可誘導機體產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，從而刺激機體產(chǎn)生氧化應激反應。氧化應激反應會破壞多種細胞內(nèi)分子，包括DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等[19]。ROS主要通過激活促炎性轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB和激活蛋白-1)直接促進腫瘤，或通過誘導DNA損傷和癌基因激活而間接促進腫瘤的發(fā)展[20-22]。LUO等[23]研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫對肝細胞的作用呈劑量依賴性，不同水平的過氧化氫可不同程度地抑制肝細胞的生長或增值，甚至可以顯著誘導G2/M期的細胞周期停滯。

KEGG信號通路富集分析顯示，蔓荊子治療肝癌主要涉及TNF、P53、HIF-1、FoxO、NF-κB、VEGR、PI3K/Akt、MAPK等信號通路。YU等[24]研究發(fā)現(xiàn)，非編碼長鏈RNA SPRY4內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1(SPRY4-IT1)在肝細胞癌中高度表達，其可促進肝細胞癌中的細胞增殖、細胞侵襲和遷移，誘導細胞周期停滯在G0/G1期并誘導細胞凋亡。TNF是由巨噬細胞分泌的一種小分子蛋白，MA等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)，SPRY4-IT1是通過TNF信號通路促進肝癌的進展和轉(zhuǎn)移。WANG等[26]研究證明，銀杏葉提取物EGb761通過NF-κB/p53信號通路抑制增殖并觸發(fā)肝癌細胞凋亡。同時，LIU等[27]研究也證明，HepG2癌細胞的抑制和凋亡機制是通過啟動p53信號傳導途徑(包括外在和內(nèi)在凋亡途徑)的生物學功能介導的。缺氧是肝細胞癌和其他實體瘤的常見特征。重要證據(jù)表明，缺氧條件下存活的肝癌細胞比正常條件下生長的細胞更具抗藥性[28-29]。ZHANG等[30]研究證明，缺氧環(huán)境下HIF-1可通過增加肝癌細胞中的SNAI1轉(zhuǎn)錄來促進上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。肝癌干細胞經(jīng)常被激活的關(guān)鍵途徑之一是NF-κB信號傳導。最新證據(jù)表明，脂多糖(LPS)在加重肝細胞癌中起關(guān)鍵作用，是肝臟腫瘤微環(huán)境中的重要介體，其通過NF-κB/HIF-1α信號通路來維持肝癌干細胞的特性[31-32]。在肝臟中，F(xiàn)oxO信號通路對于細胞增殖和新陳代謝非常重要[33]，YAMAGUCHI等[34]研究發(fā)現(xiàn)，N-甲基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑MK-801是通過FoxO信號通路抑制HepG2、HuH-7和HLF細胞增殖。VEGF表達可間接反應腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管生成情況，并提示腫瘤生長速度和轉(zhuǎn)移傾向[35]。研究顯示，丹參酮可以通過抑制VEGF/VEGFR信號通路，將肝癌細胞分裂阻滯在G0/G1期，達到抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的效果[36]。軟骨基質(zhì)低聚蛋白(COMP)會促進皮膚、肺和肝的纖維化。最新的證據(jù)表明，COMP在肝細胞癌的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[37]。LI等[38]通過研究發(fā)現(xiàn)，COMP通過激活肝細胞癌細胞中的PI3K/AKT信號通路，對腫瘤細胞的生長、代謝、增殖及轉(zhuǎn)移進行調(diào)節(jié)。

綜上所述，蔓荊子治療肝癌具有多成分、多靶點、多途徑的特點，其治療肝癌的主要活性成分是槲皮素、山柰酚，作用靶點主要涉及NCOA2、NCOA1、PGR等。同時，蔓荊子通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等生物過程，以及TNF、P53等信號通路來發(fā)揮治療肝癌的作用。本研究通過文獻調(diào)研論述方式對靶點的部分生物功能和通路進行了驗證，為今后的基礎(chǔ)研究和臨床試驗提供了理論基礎(chǔ)。