基于高通量測序分析頭頸腫瘤中CircRNAs的表達(dá)譜差異

王榴倩，沈志森，顧姍姍，鄧紅霞，李贊

頭頸腫瘤（HNC）是來源口腔上皮、咽、喉、食道、鼻腔、唾液腺和甲狀腺的惡性腫瘤[1]，5年生存率僅為40%～50%[2]，主要危險因素是吸煙、飲酒、咀嚼檳榔及病毒感染等[3]。近年來高通量測序技術(shù)以其高靈敏度、高特異性、高完整性和低成本逐漸取代基因芯片成為基因研究的主要技術(shù)[4]。CircRNAs是一類內(nèi)源性非編碼RNA（ncRNA）[5]，已有研究發(fā)現(xiàn)CircRNAs的表達(dá)失調(diào)在HNC的發(fā)生與進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-8]，但是CircRNAs在HNC中的功能機(jī)制少見報(bào)道。因此本研究旨在通過高通量測序探索HNC中的新型CircRNAs，結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證找到有意義的分子標(biāo)記物，為HNC的臨床早期診斷和精準(zhǔn)治療提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2019年12月在寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科及湖南省腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)的155例HNC患者的腫瘤組織及癌旁組織，病理均診斷為HNC。其中18例HNC患者的腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本用于高通量測序分析，其他137例HNC患者的腫瘤組織和癌旁組織樣本用于qRT-PCR驗(yàn)證部分CircRNAs的差異表達(dá)。本研究經(jīng)寧波大學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和高通量測序分析將所取得的新鮮標(biāo)本立即浸泡在含甲醛的低溫冷凍管中，并保存在－80℃的冰箱中以備后續(xù)提取總RNA。NanoPhotometer?分光光度計(jì)用于檢測樣品純度（IMPLEN，CA，USA），Qubit?3.0熒光儀（Life Technologies，CA，USA）用于檢測RNA樣本濃度，Agilent 2100 RNA Nano 6000檢測試劑盒（Agilent Technologies，CA，USA）用于檢測RNA樣本的完整性和濃度。每個樣本以3 g總RNA為起始量構(gòu)建CircRNAs文庫。使用Ribo-zero?Gold試劑盒從樣品中去除核糖體RNA（rRNA），根據(jù)Illumina（NEB，Ispawich，USA）的說明選擇不同的索引標(biāo)簽建立文庫。測序策略為PE150。通過bcl2fastq2軟件將Base調(diào)用轉(zhuǎn)換為Illumina高通量測序原始圖像數(shù)據(jù)的序列讀取，即原始數(shù)據(jù)。使用Perl腳本處理原始數(shù)據(jù)，以確保后續(xù)分析中使用數(shù)據(jù)的質(zhì)量。DEG seq或DE seq用于有或沒有重復(fù)的兩個樣本的差異表達(dá)分析。q≤0.05和|log2_ratio|≥1的基因被鑒定為差異表達(dá)基因。

1.2.2 基因本體（GO）和KEGG通路富集分析 對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（http://geneontology.org/）富集分析，根據(jù)每個GO Term所包含的差異表達(dá)基因個數(shù)，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)方法，找出與整個基因組背景相比顯著富集的GO Term。計(jì)算得到的P值通過多重檢驗(yàn)校正之后，選取q＜0.05的GO term作為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO Term。KEGG（http://www.kegg.jp/）是全基因組及代謝途徑方面的數(shù)據(jù)庫。對KEGG中每個通路應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，對得到的P值通過多重檢驗(yàn)進(jìn)行校正，以q＜0.05為閾值，滿足此條件的通路定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的通路。

1.2.3 qRT-PCR驗(yàn)證 用TRIzol試劑（Life Technologies，USA）從腫瘤和癌旁組織樣品中提取總RNA。根據(jù)Promega公司的GoScript TM反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在MX3005P熒光定量PCR儀上按照說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：5 l cDNA，5.5 l游離水，12.5 l 2xqPCR主混合液，1 l正向引物，1 l反向引物。對照基因GAPDHmRNA作為管家內(nèi)參基因。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)過程如下：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)引物如下：hsa_circ_0012212：forward，5’-CCAGCACTGGGCATGGAG-3’and reverse，5’-GGCGTTCTAGGTCCTGCTC-3’；hsa_circ_0016148：forward，5’-TCTTCAAGGGAATCCTCCGC-3’and reverse，5’-CCTTAACCAGCAGACTGGGG-3’；The primer’s sequences of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)，as a control：forward，5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’and reverse，5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’。利用Ct法分析靶基因的表達(dá)水平，△Ct=Ct（靶基因）－C（t內(nèi)參基因）。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用GraphPad Prism 7.0、Microsoft Excel 2010及SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對t檢驗(yàn)；基因表達(dá)水平與臨床資料的相關(guān)性采用單因素方差分析和非參數(shù)檢驗(yàn)；建立受試者工作特征（ROC）曲線評估hsa_circ_0012212和hsa_circ_0016148的診斷價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量測序識別CircRNAs差異表達(dá)譜 18例HNC患者的腫瘤組織及癌旁組織測序后共檢測到40577個CircRNAs，共714個CircRNAs在腫瘤組織與癌旁組織中的表達(dá)有差異（P＜0.05），其中有382個上調(diào)，332個下調(diào)。對714個表達(dá)顯著差異的CircRNAs進(jìn)行分層聚類分析，結(jié)果見封二彩圖7a所示；火山圖譜進(jìn)一步闡明了CircRNAs在腫瘤組織組和癌旁組織組中的表達(dá)差異（封二彩圖7b）。

圖7 差異表達(dá)CircRNAs的聚類圖（a）和火山圖（b）

2.2 CircRNAs的GO和KEGG通路分析 差異表達(dá)CircRNAs的生物過程變化主要發(fā)生在5-甲基胞嘧啶分解代謝過程和5-甲基胞嘧啶代謝過程中。分子功能的變化主要集中在（R）-檸檬烯6-單加氧酶活性、（S）-檸檬烯6-單加氧酶活性、（S）-檸檬烯7-單加氧酶活性和ATP結(jié)合。細(xì)胞組成分析揭示了與高爾基體有關(guān)的CircRNAs的差異表達(dá)。KEGG通路分析顯示，差異表達(dá)的CircRNAs在ErbB信號通路和腫瘤Micro RNAs信號通路顯著富集。此外，差異表達(dá)的CircRNAs也在胰島素維持、破骨細(xì)胞分化、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路和孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路富集，排序前11的KEGG通路富集圖也顯示了相似的結(jié)果。

2.3 qRT-PCR驗(yàn)證部分差異表達(dá)CircRNAs對高通量測序結(jié)果中差異表達(dá)的CircRNAs進(jìn)行ceRNA預(yù)測分析，篩選出部分能參與構(gòu)成CircRNA-miRNAmRNA互作關(guān)系的CircRNAs，從中選出表達(dá)明顯下調(diào)的hsa_circ_0012212、hsa_circ_0016148 二 條 CircRNAs。hsa_circ_0012212和hsa_circ_0016148在腫瘤組織中的表達(dá)水平均低于癌旁組織（均P＜0.05）（封二彩圖8）。

圖8 qRT-PCR驗(yàn)證，a為hsa_circ_0012212，b為hsa_circ_0016148

2.4 差異表達(dá)CircRNAs與臨床資料的相關(guān)性 hsa_circ_0012212的表達(dá)與年齡有關(guān)（P＜0.05），而與腫瘤類別、吸煙、飲酒、分化程度、TNM分期、侵襲能力及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（均P＞0.05）。hsa_circ_0016148與腫瘤分類和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與其他因素均無關(guān)（均P＞0.05）。見表1～2。

表1 hsa_circ_0012212表達(dá)水平（Ct）與HNC患者臨床資料的相關(guān)性

2.5 ROC曲線分析 hsa_circ_0012212的曲線下面積（AUC）為0.628，hsa_circ_0016148的AUC為0.596，hsa_circ_0012212作為HNC診斷分子標(biāo)志物的敏感性更高。

3 討論

高通量測序和計(jì)算分析顯示環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本在真核生物轉(zhuǎn)錄組中廣泛存在[9-10]，在各種組織和不同物種中大量穩(wěn)定表達(dá)[11-14]，通過反向剪接外顯子或內(nèi)含子的pre-mRNA新發(fā)現(xiàn)了大量的circRNAs[15-16]。CircRNAs的高度保守和穩(wěn)定性（半衰期＞48 h）提示circRNAs在癌癥診斷方面可能優(yōu)于miRNAs和長鏈非編碼RNA（lncRNAs）。

Ke等[17]發(fā)現(xiàn)circHIPK3在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，circHIPK3通過保護(hù)ELF3免受miRNA-4288介導(dǎo)的沉默作用從而促進(jìn)了鼻咽癌的進(jìn)展，同時circHIPK3的耗竭顯著抑制了體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Wu等[18]發(fā)現(xiàn)CircRNA hg19_circ_0005033可促進(jìn) CD133+CD44+喉癌干細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示CircRNA與癌癥免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。Feng等[19]通過CircRNA基因測序發(fā)現(xiàn)，下咽癌腫瘤組織與鄰近正常組織中有173個CircRNA差異表達(dá)，其中上調(diào)的CircRNA 71個，下調(diào)的CircRNA 102個。還發(fā)現(xiàn)了CircRNA（hsa_circ_0008287和hsa_circ_0005027）和miRNA（has-miRNA-548c-3p）組成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)對ErbB和Hippo信號通路均有顯著影響。以上這些研究闡明了CircRNA在HNC中的作用，啟示研究HNC癌變和發(fā)展的分子機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)早期診斷的生物標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，差異表達(dá)的CircRNAs有714個，其中上調(diào)的CircRNAs有382個，下調(diào)的CircRNAs有332個。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些circBase中沒有包含的CircRNAs，這些新發(fā)現(xiàn)的CircRNAs豐富了非編碼RNA家族。然后還發(fā)現(xiàn)CircRNAs的主要功能和通路與腫瘤相關(guān)，如ErbB信號通路和腫瘤MicroRNAs信號通路，為進(jìn)一步研究HNC的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。在本研究中，通過選擇2個差異表達(dá)的CircRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，顯示在腫瘤組織中hsa_circ_0012212和hsa_circ_0016148表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HNC腫瘤組織中低表達(dá)的hsa_circ_0012212與年齡相關(guān)，hsa_circ_0016148與腫瘤分類和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P＜0.05），這提示不同的CircRNA有不同的診斷價值。ROC曲線分析顯示hsa_circ_0012212的AUC為0.628，比hsa_circ_0016148的0.596要高，這說明hsa_circ_0012212在HNC的分子診斷中具有更高的敏感性。本研究HNC中各腫瘤類型的樣本量不相同，在將來需要對各個腫瘤類型作擴(kuò)大樣本量的研究。盡管hsa_circ_0012212和hsa_circ_0016148在HNC中的作用才剛被揭示，但是其作為診斷分子標(biāo)志物和治療的潛在價值將為HNC的生物治療帶來更廣的應(yīng)用前景。

表2 hsa_circ_0016148表達(dá)水平（Ct）與HNC患者臨床資料的相關(guān)性