TRIP13通過激活Notch1通路促進肝癌細(xì)胞對索拉非尼耐藥的機制研究

陶冬英，任典寰，范任華，楊菊林，于紀(jì)棉

索拉非尼是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的治療晚期肝癌的一線靶向藥物，能顯著提高患者的中位生存時間，但隨著治療時間的延長，許多患者表現(xiàn)出耐藥性[1]，目前耐藥機制還不是特別清楚。甲狀腺激素受體相互作用蛋白13（TRIP13）是AAA+ATP酶超家族中的一員，位于染色體5p15.33，其在有絲分裂過程中紡錘體組裝檢查點和DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)，TRIP13在肝癌中的表達上調(diào)，且過表達TRIP13可促進肝癌的發(fā)展進程[3-4]，但是TRIP13與肝癌細(xì)胞的索拉非尼耐藥的關(guān)系目前相關(guān)報道未見。本研究擬建立索拉非尼耐藥性HepG2細(xì)胞株，來探究TRIP13在肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥中的作用和機制。報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞所，MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，索拉非尼購自美國Sigma公司，TransScript Reverse Transcriptase和2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，TRIP13兔多克隆抗體（1∶1 000）購自美國Thermo Fisher公司；Notch1兔單克隆抗體和Hes1兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，TRIzol試劑和Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，MTT試劑盒和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TRIP13 siRNA序列和對照序列由上海吉瑪公司合成：si-TRIP13序列，5’-GCTGGTAACCAAGATGTTT-3’；si-NC序列，5’-GCTCAATGAACGTAGGTTT-3’。

1.2 索拉非尼耐藥性HepG2細(xì)胞株的建立 采用濃度遞增法對HepG2肝癌細(xì)胞進行長時間的培養(yǎng)，建立索拉非尼耐藥HepG2細(xì)胞株（HepG2-SR）模型。選取HepG2為親本細(xì)胞，使用MEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，在培養(yǎng)液中加入1M索拉非尼，培養(yǎng)1周后，換成更高濃度的索拉非尼（每次增加1M），直至細(xì)胞能在10M索拉非尼培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長，表明HepG2-SR細(xì)胞成功誘導(dǎo)。

1.3 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將2×106個HepG2-SR細(xì)胞接種到6孔板中，過夜貼壁后，細(xì)胞融合度達到60%左右，將細(xì)胞分成3組：對照組、si-NC組及si-TRIP13組。后兩組細(xì)胞按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書操作分別將50 nMsi-NC和50 nMsi-TRIP13轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基。對照組細(xì)胞不進行任何處理，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 MTT檢測 細(xì)胞活力使用MTT檢測。分別將HepG2和HepG2-SR細(xì)胞按照3×103個/孔的密度接種至96孔板里，每孔加入1、5、10或者20M索拉非尼。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10l MTT溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h，加入100l異丙醇溶解沉淀，最后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度值。使用Graphpad Prism 5軟件計算索拉菲尼的IC50（即抑制率50%時索拉菲尼的濃度）。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將2×106個HepG2-SR細(xì)胞接種到6孔板中，按照上述方式轉(zhuǎn)染50 nM si-TRIP13和50 nM si-NC，轉(zhuǎn)染48 h后，加入10M索拉非尼培養(yǎng)24 h。用適量胰酶消化細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。取1×106個重懸細(xì)胞，1000 g離心5min，去除上清后加入195l Annexin V-FIT C結(jié)合液、5l Annexin V-FITC和10l碘化丙啶（PI），室溫避光孵育15 min后使用流式細(xì)胞儀進行檢測。

1.6 Real-time PCR檢測 細(xì)胞中TRIP13、E-cadherin和Vimentin mRNA水平使用real-time PCR方法檢測。利用TRIzol試劑提取各處理組中細(xì)胞的總RNA。使用oligo（dT）引物將2g總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照PCR試劑盒說明書操作加入模板和引物，配置25l的反應(yīng)體系，按照下面條件進行PCR反應(yīng)94℃5 min；94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，共35個循環(huán)；72℃5 min。TRIP13上游引物：5’-GCTTCCCCATCTGGTGCTTT-3’，下游引物：5’-GTGGCTTTCTAGCTTGCAGTC-3’；E-cadherin上游引物：5’-AGGGGTTAAGCACAACAGCA-3’，下游引物：5’-GGTGTATACAGCCTCCCACG-3’；Vimentin上游引物：5’-TCCGCACATTCGAGCAAAGA-3’，下游引物：5’-TGATTCAAGTCTCAGCGGGC-3’；-actin上游引物：5’-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3’，下游引物：5’-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’。使用-actin作為內(nèi)參，按照公式2－Ct計算TRIP13、Ecadherin和Vimentin mRNA的表達量。

1.7 Western blot檢測 將適量RIPA裂解液加入細(xì)胞中，充分裂解后，12 000 g離心15 min。蛋白濃度使用BCA法進行測定。每個樣品取40g蛋白，沸水浴變性后上樣進行SDS-PAGE電泳。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，用溶解于TBST緩沖液中的5%脫脂奶粉封閉2 h。然后加一抗4°C過夜孵育，接下來使用TBST緩沖液清洗3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再加入ECL發(fā)光液顯色。以-actin為內(nèi)參，計算TRIP13、Notch1和Hes-1蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件分析，所有實驗最少重復(fù)3次，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIP13表達及MTT結(jié)果 采用濃度遞增法對HepG2肝癌細(xì)胞進行長時間培養(yǎng)，建立HepG2-SR細(xì)胞模型。MTT檢測顯示索拉非尼對HepG2和HepG2-SR細(xì)胞的IC50分別為4.72M和26.42M（圖1A）。HepG2-SR細(xì)胞的IC50比HepG2細(xì)胞增加了5.6倍，這說明HepG2-SR細(xì)胞成功建立。Realtime PCR和westernblot檢測TRIP13 mRNA和蛋白水平表達，結(jié)果如圖1B和1C所示：與HepG2細(xì)胞相比，HepG2-SR細(xì)胞中TRIP13 mRNA和蛋白水平均顯著增加（P＜0.05）。

圖1 HepG2-SR細(xì)胞中TRIP13表達上調(diào)

2.2 HepG2-SR細(xì)胞對索拉非尼的敏感性 檢測不同處理的HepG2-SR細(xì)胞中TRIP13表達，結(jié)果顯示：與si-NC組相比，si-TRIP13組中TRIP13的表達顯著降低（P＜0.05，圖2A）。MTT檢測各組細(xì)胞中的IC50，結(jié)果顯示：si-NC組和si-TRIP13組中IC50分別為27.30M和8.94M。與si-NC組相比，si-TRIP13組中IC50顯著降低（P＜0.05，圖2B）。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果見圖2C：與si-NC組相比，si-TRIP13組中凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P＜0.05）。

圖2 下調(diào)TRIP13可增加HepG2-SR細(xì)胞對索拉非尼的敏感性

2.3 HepG2-SR細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 結(jié)果如圖3所示：與si-NC組相比，si-TRIP13組中E-cadherin mRNA表達顯著增加，Vimentin mRNA水平顯著降低（P＜0.05）。

圖3 下調(diào)TRIP13可抑制HepG2-SR細(xì)胞的EMT

2.4 生物信息學(xué)預(yù)測肝癌組織中TRIP13與Notch1的關(guān)系 使用Starbase軟件分析TRIP13與Notch1基因在374例肝癌組織中的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)TRIP13表達與Notch1水平在肝癌組織中呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.33，P＜0.01）。見圖4。

圖4 TRIP13與Notch1表達在肝癌組織中的相關(guān)性分析

2.5 下調(diào)TRIP13可抑制Notch1通路活化 Western blot檢測HepG2-SR細(xì)胞中Notch1和Hes-1表達，結(jié)果如圖5所示，與si-NC組相比，si-TRIP13組中Notch1和Hes-1降低（P＜0.05）。

圖5 HepG2-SR細(xì)胞中下調(diào)TRIP13可抑制Notch1通路活化

3 討論

AAA+ATP酶家族包含53個成員，這個家族的蛋白通過水解ATP產(chǎn)生機械能改變蛋白質(zhì)和多核苷酸的構(gòu)象，在蛋白質(zhì)降解、DNA復(fù)制和膜融合事件中發(fā)揮作用[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，AAA+ATP酶家族蛋白參與了多種腫瘤的發(fā)生和進展過程[6]。TRIP13是AAA+ATP酶家族中比較保守的一個成員，在多種腫瘤中其表達明顯上調(diào)，且表達量與患者的不良預(yù)后相關(guān)。最近的文獻報道顯示，TRIP13在肝癌組織中表達升高，高水平的TRIP13與患者較差的預(yù)后有關(guān)。過表達TRIP13可促進肝癌生長和轉(zhuǎn)移[3]，但是目前國內(nèi)外還沒有文獻報道TRIP13與肝癌索拉非尼耐藥的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，HepG2索拉非尼耐藥性細(xì)胞株HepG2-SR中TRIP13表達較HepG2親本細(xì)胞高，這表明TRIP13可能參與了肝癌細(xì)胞的索拉非尼耐藥。使用siRNA技術(shù)在HepG2-SR細(xì)胞中下調(diào)TRIP13，發(fā)現(xiàn)下調(diào)TRIP13后，索拉非尼對細(xì)胞的IC50值降低，細(xì)胞凋亡增加。這表明下調(diào)TRIP13可增加肝癌細(xì)胞對索拉非尼的敏感性。

研究已經(jīng)證實EMT不僅在肝癌進程中促進惡性肝癌細(xì)胞的擴散，也在包含索拉非尼在內(nèi)的多種藥物耐藥中發(fā)揮著重要作用，抑制EMT可逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對藥物的耐藥[7-8]。在多種癌癥中都發(fā)現(xiàn)TRIP13可以調(diào)節(jié)EMT進程[3,9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TRIP13可抑制HepG2-SR細(xì)胞的EMT。這表明TRIP13增加肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥與其促進EMT有關(guān)。Wang等[10]的研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號在索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞中被激活，而且Notch1信號活化能夠促進肝癌細(xì)胞對索拉非尼耐藥。Notch1是調(diào)控癌細(xì)胞發(fā)生EMT的一個重要信號通路[11]。本課題組通過生物信息學(xué)的方法分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中TRIP13與Notch1的表達呈現(xiàn)正相關(guān)。這說明在肝癌的索拉非尼耐藥中TRIP13可能與Notch1存在著某種聯(lián)系。Hes-1是Notch1下游一個重要的調(diào)控分子，本研究結(jié)果顯示，下調(diào)TRIP13顯著降低了Notch1和Hes-1的表達，這表明下調(diào)TRIP13可抑制Notch1通路的活化。

綜上所述，TRIP13在索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞中表達升高，它可增加肝癌細(xì)胞對索拉非尼耐藥，這可能是通過激活Notch1通路，進而促進肝癌細(xì)胞的EMT引起的。TRIP13的水平可能是預(yù)測肝癌細(xì)胞對索拉非尼反應(yīng)的一個潛在標(biāo)志物，聯(lián)合TRIP13拮抗劑和索拉非尼治療可能能夠增強索拉非尼抗肝癌的治療效果。