福建北部海域海地瓜（Acaudina m olpadioides）的性腺發(fā)育研究

鄭碧琪，魯超，劉煒*，郭玉臣，黃文，程宏，林婧

( 1.寧德海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，福建寧德352100；2.自然資源部海洋生態(tài)監(jiān)測(cè)與修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201206)

1 引言

海地瓜（Acaudinamolpadioides）隸屬于棘皮動(dòng)物門（Echinodermata）海參綱（Holothuroidea）芋參目（Molpadida）尻參科（Caudinidae）海地瓜屬（Acaudina），雌雄異體，體呈紡錘形，大者體長(zhǎng)可達(dá)20 cm（圖1）。海地瓜廣泛分布于我國(guó)山東至海南島以及孟加拉灣、印度尼西亞、菲律賓、澳大利亞、日本等地，幼體階段浮游生活，成體穴居在潮間帶至水深80 m的軟泥底中，少數(shù)生活在泥沙、沙泥、沙底中[1]。海地瓜作為一種低值海參，營(yíng)養(yǎng)豐富，為高蛋白低脂肪食品，還含有皂苷、多糖、多肽等多種活性物質(zhì)，具有巨大的開發(fā)潛力和市場(chǎng)價(jià)值[2–7]。

圖1 海地瓜圖Fig.1 The pictureof A.molpadioides

2015年8月，大量海地瓜在某濱海核電廠取水口聚集，導(dǎo)致機(jī)組的兩臺(tái)海水循環(huán)泵跳閘，反應(yīng)堆停止運(yùn)作，給核電運(yùn)行帶來一定的安全隱患[8]。國(guó)內(nèi)外由海洋生物大量聚集導(dǎo)致的核電廠取水系統(tǒng)安全事件常見報(bào)道，如水母、毛蝦、魚群、藻類等[9–11]，但是由海地瓜導(dǎo)致的核電廠安全事件屬于首次，因此海地瓜這一物種引起了有關(guān)方面的高度重視。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)海地瓜的研究工作主要集中在營(yíng)養(yǎng)成分、活性物質(zhì)等方面[2?7]，對(duì)其繁殖生物學(xué)相關(guān)研究基本空白。本研究運(yùn)用組織學(xué)方法對(duì)海地瓜性腺發(fā)育特征進(jìn)行觀察并劃分發(fā)育階段，同時(shí)選擇性腺指數(shù)、性腺長(zhǎng)度、生殖管直徑3個(gè)指標(biāo)對(duì)海地瓜性腺進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。根據(jù)長(zhǎng)期的組織學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，本文總結(jié)了海地瓜的性腺發(fā)育特征及其周年變化規(guī)律，并進(jìn)一步探究其精卵排放類型、性別比、生殖周期、繁殖季節(jié)等內(nèi)容，以期豐富海地瓜這一物種的繁殖生物學(xué)基礎(chǔ)資料。這些研究結(jié)果不僅可以為海地瓜的養(yǎng)殖繁育、高值化開發(fā)利用提供理論參考，還可以為濱海核電廠鄰近海域的海地瓜異常聚集災(zāi)害防控工作提供科學(xué)指導(dǎo)。

2 材料與方法

2.1 材料

海地瓜樣本為野外采集，使用阿氏拖網(wǎng)采自福建北部近岸海域的沉積物中。于2018年1?12月，每月采樣1次，每月樣本數(shù)量為10～35只，個(gè)體的體壁重量為10～20 g，樣本帶回實(shí)驗(yàn)室觀察、解剖、分析等。

2.2 方法

2.2.1 性腺形態(tài)學(xué)觀察與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

解剖海地瓜，觀察其性腺特征。剝離性腺和體壁，用吸水紙將性腺和體壁表面水分吸干后用電子天平分別稱量濕重，用以計(jì)算性腺指數(shù)（GI，性腺指數(shù)=性腺濕重÷體壁濕重×100）。用游標(biāo)卡尺測(cè)量生殖管匯合處到生殖管游離端的長(zhǎng)度，每個(gè)性腺在不同位置測(cè)量10次后取平均值代表該性腺長(zhǎng)度。在Olympus SZX16顯微鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量有代表性的10根生殖管的直徑，取平均值后代表該性腺的生殖管直徑。將每月所有樣本的性腺指數(shù)、性腺長(zhǎng)度、生殖管直徑分別取平均值，以此表征該月海地瓜性腺指標(biāo)值，整理1?12月各項(xiàng)性腺指標(biāo)值，并繪制折線圖。

2.2.2 性腺組織切片制作、性腺分期與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將上述稱重、測(cè)量完畢的海地瓜性腺逐一編碼后分別置于Bouin氏液中固定，然后委托福州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司制作組織切片（HE染色），切片制作完成后送回本實(shí)驗(yàn)室，在Olympus BX 43顯微鏡下觀察拍照，并參考廖玉麟[1]、Ramofafia等[13]描述的海參性腺發(fā)育特征進(jìn)行性腺發(fā)育分期。個(gè)體發(fā)育時(shí)期鑒定以性腺切片中占切片面積50%以上的性細(xì)胞發(fā)育時(shí)相為準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)每月樣本中不同發(fā)育時(shí)期的個(gè)體數(shù)占當(dāng)月樣本總數(shù)的百分比，并繪制柱形圖。

2.2.3 雌雄性別比例統(tǒng)計(jì)

通過對(duì)各性腺樣本進(jìn)行組織學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察，判斷雌雄，記錄各樣本的性別，分別統(tǒng)計(jì)雌雄個(gè)體數(shù)量，計(jì)算海地瓜的性別比例。

3 結(jié)果

3.1 海地瓜的性腺形態(tài)特征、性別比例

海地瓜雌雄性腺均由許多分枝狀的生殖管構(gòu)成，在基部連成一簇，位于身體前部體腔；生殖管一端封閉，另一端匯合成一總管，開口于觸手稍后方的生殖孔；生殖管長(zhǎng)短不均一，長(zhǎng)度通常為2～5 cm（圖1 c，圖2 a）。雌雄性腺在不同的發(fā)育階段呈現(xiàn)不同的顏色，如成熟精巢為淡黃色（圖2 b），成熟卵巢為粉橘色（圖2 c）。

本研究在福建北部近岸海域共采集海地瓜樣本222只，通過性腺觀察，可明確性別的個(gè)體為197只，其中雌性94只、雄性103只，性別比例接近1∶1。

3.2 海地瓜性腺發(fā)育分期

根據(jù)性腺組織切片觀察結(jié)果，海地瓜雌雄性腺的發(fā)育均可劃分為6個(gè)時(shí)期，即休止期（I）、發(fā)育早期（II）、增長(zhǎng)期（III）、成熟期（IV）、部分排放期（V）和排空期（VI）。

3.2.1 雄性性腺（精巢）發(fā)育分期

休止期（I）：生殖管呈橙黃色，直徑為0.8～1.0mm，生殖管壁厚，生殖上皮幾乎不可見精原細(xì)胞和精母細(xì)胞（圖3 a）。

發(fā)育早期（II）：生殖管呈橙黃色，直徑為1.0～1.2mm，生殖管壁厚，生殖上皮可見少量精原細(xì)胞和精母細(xì)胞（圖3 b，圖3 c）。

增長(zhǎng)期（III）：生殖管呈黃色，直徑增大，為1.2～1.4 mm，生殖管腔明顯，管壁富有彈性。生殖上皮明顯褶皺，往腔中延伸。生殖上皮附著大量精原細(xì)胞（直徑為3.5～4.0μm）和精母細(xì)胞（直徑約3.0μm），生殖管腔中出現(xiàn)成熟精子（圖3 d，圖3 e）。

成熟期（IV）：生殖管呈淡黃色（圖2 b），直徑顯著增大，可達(dá)1.6～2.0mm。生殖管腔中密布成熟的精子（直徑約1.5 μm）。此時(shí)生殖管壁很薄，生殖上皮褶皺基本消失，其上附著少量精母細(xì)胞（圖3 f，圖3 g）。

部分排放期（V）：生殖管收縮，直徑顯著變小，為0.6 ～1.0 mm，生殖上皮重新出現(xiàn)褶皺，生殖管腔中的精子密度明顯變少，生殖上皮依然附著精母細(xì)胞（圖3 h）。

排空期（VI）：生殖管極度收縮退化，直徑很小，約0.3 mm，生殖管腔排空，有極少數(shù)精子殘留，生殖上皮幾乎沒有精母細(xì)胞附著（圖3 i）。

3.2.2 雌性性腺（卵巢）發(fā)育分期

休止期（I）：生殖管呈橙黃色，直徑為0.8 ～1.0 mm，生殖管壁厚，生殖上皮幾乎不可見卵原細(xì)胞和卵母細(xì)胞（圖4 a）。

發(fā)育早期（II）：生殖管呈橙黃色，直徑為1.0 ～1.2 mm，生殖管壁厚。生殖上皮可見少量卵原細(xì)胞（直徑約20μm）和卵黃發(fā)生前的卵母細(xì)胞（直徑為50～80μm），呈嗜堿性，HE染色呈藍(lán)紫色（圖4 b）。

增長(zhǎng)期（III）：生殖管呈淡黃色，直徑增大，約1.5 mm。生殖管腔中出現(xiàn)卵黃發(fā)生期卵母細(xì)胞（直徑約120μm）和成熟卵細(xì)胞（直徑約200μm），HE染色呈紅色。生殖上皮附近是卵原細(xì)胞及卵黃發(fā)生前的卵母細(xì)胞群（圖4 c）。

圖4 海地瓜卵巢不同發(fā)育階段的組織結(jié)構(gòu)特征Fig.4 Histological featuresof A.molpadioides ovary at different stages

成熟期（IV）：生殖管呈粉橘色（圖2 c），管粗，直徑可達(dá)1.8 ～2.0 mm，管壁透明富有彈性。管內(nèi)充滿成熟卵細(xì)胞，直徑可達(dá)200μm，幾乎肉眼可見。由于卵細(xì)胞體積大、數(shù)量多，在有限的管腔中互相擠壓，其形狀呈不規(guī)則多邊形。生殖上皮附著少量卵黃發(fā)生前卵母細(xì)胞（圖4 d）。

部分排放期（V）：生殖管呈淡粉色，收縮變細(xì)，直徑為0.6 ～1.0 mm。大部分卵細(xì)胞已經(jīng)排放，管腔中卵細(xì)胞數(shù)量明顯變少。生殖上皮附著有卵黃發(fā)生前卵母細(xì)胞。此時(shí)管腔中出現(xiàn)吞噬細(xì)胞（圖4 e）。

排空期（VI）：生殖管呈黃色，變得空癟，直徑僅約0.3 mm，長(zhǎng)度也明顯收縮。管腔中的卵細(xì)胞幾乎全部排放，僅余極少量卵母細(xì)胞，此時(shí)殘留的性細(xì)胞正在崩壞。管腔中可見吞噬細(xì)胞。管腔中還有殘留的塊狀物，為性細(xì)胞的崩壞產(chǎn)物（圖4 f）。

3.3 海地瓜性腺組織學(xué)周年觀察結(jié)果

海地瓜性腺組織學(xué)的周年觀察結(jié)果如圖5 所示，每個(gè)月份的雌雄海地瓜所處的發(fā)育時(shí)期是一致的，說明同一時(shí)期雌雄海地瓜性腺發(fā)育程度基本同步。休止期（I）個(gè)體出現(xiàn)在8?10月，發(fā)育早期（II）個(gè)體出現(xiàn)在11月至翌年3月，增長(zhǎng)期（III）個(gè)體出現(xiàn)在4?5月，成熟期（IV）個(gè)體僅出現(xiàn)在5月，部分排放期（V）個(gè)體出現(xiàn)在5?8月，排空期（VI）個(gè)體出現(xiàn)在6?9月?？傮w上看，海地瓜性腺組織的發(fā)育有時(shí)間規(guī)律性，呈一定的季節(jié)相關(guān)性。

圖5 海地瓜精巢（a）和卵巢（b）發(fā)育的周年變化Fig.5 Annual variation of testis (a)and ovary (b)development in A.molpadioides

3.4 海地瓜性腺形態(tài)學(xué)周年觀察結(jié)果

由于海地瓜精巢和卵巢的外在形態(tài)一樣（都是由分枝狀的生殖管構(gòu)成），并且其組織發(fā)育基本同步（圖5），因此精巢和卵巢在形態(tài)上的周年變化也大致同步，故不對(duì)雌雄形態(tài)學(xué)各指標(biāo)值（性腺指數(shù)、性腺長(zhǎng)度、生殖管直徑）分別統(tǒng)計(jì)。1?12月海地瓜的形態(tài)變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6 所示，各指標(biāo)值的周年變化趨勢(shì)有一定的相似性。

圖6 海地瓜性腺形態(tài)的周年變化Fig.6 Annualvariation of gonadal morphology in A.molpadioides

海地瓜性腺指數(shù)的全年平均值為17.3，最高值出現(xiàn)在5月，低值出現(xiàn)在6月和7月。5月海地瓜性腺指數(shù)平均值為25.5 ，指數(shù)范圍為9.2 ～42.9 ，跨度較大；6月、7月海地瓜性腺指數(shù)平均值分別為3.4 、4.0 ，指數(shù)范圍為0.8 ～10.6 。6月是海地瓜性腺指數(shù)變化的拐點(diǎn)，該月性腺指數(shù)驟降至最低值，7月持續(xù)走低，8月起性腺指數(shù)有明顯回升并在之后的月份里穩(wěn)定上升直至翌年5月。

海地瓜性腺長(zhǎng)度的全年平均值為3.4 cm。10月至翌年4月性腺長(zhǎng)度較為穩(wěn)定，在4 cm左右，5月性腺長(zhǎng)度有一定下降，6月、7月性腺長(zhǎng)度降至最低值，8月、9月性腺長(zhǎng)度逐漸升高。5月海地瓜性腺長(zhǎng)度平均值為3.4 cm，長(zhǎng)度范圍為1.8 ～4.1 cm；6月、7月性腺長(zhǎng)度平均值為分別為2.0 cm、1.9 cm，長(zhǎng)度范圍為1.0 ～4.0 cm。

海地瓜生殖管直徑的全年平均值為1.0 mm，最大值出現(xiàn)在5月，低值出現(xiàn)在6月、7月，8月起生殖管直徑逐漸回升直至翌年5月。5月海地瓜生殖管直徑平均值為1.29 mm，直徑范圍為0.6 ～2.0 mm；6月、7月樣本的生殖管直徑平均值分別為0.52 mm、0.56 mm，直徑范圍為0.3 ～0.8 mm。

4 討論

4.1 海地瓜的性別比

統(tǒng)計(jì)海地瓜樣本的雌雄個(gè)體數(shù)量，雄性103只、雌性94只，結(jié)果顯示海地瓜性別比例接近1∶1。許多學(xué)者的統(tǒng)計(jì)表明大多數(shù)海參雌雄比例基本接近1∶1，如Ramofafia等[13]報(bào)道所羅門群島糙海參（Holothuria scabra）的雄參428只、雌參414只；楊學(xué)明等[14]統(tǒng)計(jì)海南島糙海參的雄參66只、雌參62只，尖塔海參（Holothuria spinifera）的雄參96只、雌參86只[15]，Psolus fabricii的雄參595只、雌參607只[16]。Cameron和Fankboner[17]認(rèn)為，海參雌雄比1∶1有助于增加卵子受精的幾率。

4.2 海地瓜性腺發(fā)育的組織結(jié)構(gòu)特征

從性腺發(fā)育的全過程看，海地瓜性腺發(fā)育在精/卵原細(xì)胞、精/卵母細(xì)胞、配子數(shù)量、生殖管壁厚度、生殖上皮等方面發(fā)生了一系列顯著變化。在性腺發(fā)育的早期階段，少量的精原細(xì)胞和卵原細(xì)胞出現(xiàn)并附著在生殖上皮上；中期階段（成熟期）精子和卵細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到最大，充滿生殖管腔；后期階段隨著配子排放，生殖管腔變空。在整個(gè)性腺發(fā)育過程中，生殖管壁逐漸變薄，生殖上皮褶皺出現(xiàn)、消失又重現(xiàn)?？梢姾５毓闲韵僭诓煌l(fā)育階段變化顯著，利用上述特征的變化可判斷海地瓜個(gè)體性腺發(fā)育所處的階段以及群體的發(fā)育水平。

在增長(zhǎng)期（III），海地瓜精巢生殖管上皮發(fā)生明顯的褶皺且往管腔中延伸（圖3 d），在糙海參[18]和黃乳海參（Holothuria fuscogilva）[19]的增長(zhǎng)期精巢中也有這樣的形態(tài)。Cameron和Fankboner[17]認(rèn)為，生殖管上皮褶皺的作用是增大精子發(fā)生的面積，Giese等[20]也發(fā)現(xiàn)褶皺的生殖管上皮有利于管壁的上皮細(xì)胞從血液中吸收更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給精母細(xì)胞發(fā)育。筆者同意上述觀點(diǎn)。在海地瓜精巢發(fā)育成熟之前，精子的發(fā)育、增殖需要通過生殖上皮從血液中攝取大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)精子發(fā)育完成后，不再需要褶皺的生殖上皮提供營(yíng)養(yǎng)，褶皺減少或消失，性腺進(jìn)入成熟期。

在海地瓜卵巢發(fā)育的部分排放期（V ）和排空期（VI）出現(xiàn)吞噬細(xì)胞。吞噬細(xì)胞是卵巢發(fā)育晚期的顯著特征，其作用是吞噬并分解殘留的卵細(xì)胞，將其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給位于生殖上皮附近正在發(fā)育的卵母細(xì)胞。在糙海參[18]、P. fabricii[16]和Stichopusmollis[21]這3種海參的卵巢發(fā)育中也有類似情況，說明吞噬細(xì)胞的存在可能是海參綱物種卵巢發(fā)育過程中的一種普遍現(xiàn)象。

4.3 海地瓜的精卵排放類型

在大多數(shù)海地瓜性腺組織切片中觀察到一個(gè)切片中同時(shí)存在多個(gè)發(fā)育階段的性細(xì)胞，特別是處于增長(zhǎng)期（III）、成熟期（IV）和部分排放期（V）的性腺切片中，除了精/卵細(xì)胞外，還有精/卵母細(xì)胞同時(shí)存在，因此推測(cè)海地瓜性腺發(fā)育模式為非同步發(fā)育，配子分批成熟。此外，處于部分排放期（V）的性腺說明海地瓜配子呈現(xiàn)部分排放現(xiàn)象，這種情況也見于對(duì)其他海參的報(bào)道，如糙海參[14]、黃乳海參[19]、仿刺參（Apostichopus japonicus）[22]。廖玉麟[1]認(rèn)為，海參并不是一次把生殖細(xì)胞都排放掉，而是間斷排放?？梢姾５毓蠈儆诙啻闻啪杨愋汀?/p>

4.4 海地瓜性腺發(fā)育的周年變化規(guī)律

《中國(guó)動(dòng)物志：棘皮動(dòng)物門（海參綱）》中對(duì)海參生殖的相關(guān)描述為，海參的生殖過程大體上相似，先是精卵排放，后是生殖管的破壞，再是在生殖腺基部的生長(zhǎng)帶長(zhǎng)出新管[1]。結(jié)合圖5 和圖6 中海地瓜性腺組織學(xué)和形態(tài)學(xué)的周年觀察結(jié)果，本文推測(cè)，海地瓜性腺發(fā)育的周年變化規(guī)律如下：5月大多數(shù)海地瓜性成熟，并開始分別排放精子和卵細(xì)胞，配子排放持續(xù)到8月結(jié)束。精卵排放過程中同時(shí)伴隨著生殖管的自體破壞，然后長(zhǎng)出新管，性腺開始新一輪發(fā)育。8?10月新的生殖管逐漸生長(zhǎng)，11月新的生殖細(xì)胞開始生成并發(fā)育，至翌年3月性腺基本還處于發(fā)育早期階段，4月性腺進(jìn)入增長(zhǎng)期，生殖細(xì)胞發(fā)育迅速，至5月大量生殖細(xì)胞成熟，即性腺成熟。如此循環(huán)往復(fù)，海地瓜完成一輪又一輪生殖繁育活動(dòng)。并由此可知，海地瓜生殖為明顯的周年生殖類型，即生殖周期為1年，同樣大連沿海的仿刺參[23]以及澳大利亞的糙海參[24]其生殖周期也為1年。

4.5 海地瓜的繁殖季節(jié)

根據(jù)海地瓜性腺發(fā)育的周年變化，可知海地瓜性腺成熟時(shí)間在5月，并且在5?8月進(jìn)行了配子排放，因此本研究推斷，海地瓜的繁殖期在5?8月（夏季）。Thorson[25]提出熱帶海洋無脊椎動(dòng)物隨著緯度增高，其繁殖規(guī)律由持續(xù)性產(chǎn)卵變成季節(jié)性產(chǎn)卵的假說。以糙海參為例，所羅門群島（9°S）的糙海參能夠全年產(chǎn)卵繁殖[13]；海南島（18° N）的糙海參種群在全年絕大部分時(shí)間均可繁殖，繁殖盛期為5?8月（夏季）及12月至翌年2月（冬季）[14]；新喀里多尼亞（21°S）的糙海參的繁殖期在每年夏季和冬季，即一年2次[26]；澳大利亞（27°S）的糙海參繁殖期為每年1次，每年集中在夏季產(chǎn)卵[24]?？梢姴煌暥葪⒌氐牟诤⒌姆敝称诓槐M相同，其繁殖規(guī)律呈明顯的地域性特點(diǎn)，符合Thorson[25]的假說。本研究的海地瓜樣本采自福建北部近岸海域（27° N），其繁殖期為一年1次，集中在5?8月（夏季）。那么其他緯度地區(qū)的海地瓜的繁殖時(shí)間如何，則有待進(jìn)一步研究。