海假交替單胞菌（Pseudoalterom onas marina）鞭毛蛋白對(duì)生物被膜形成及厚殼貽貝附著的影響

蔡雨珊，張秀坤，竹攸汀,3，楊金龍,3，梁簫,3*

(1.上海海洋大學(xué)國(guó)家海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心，上海201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州)，廣東廣州511458)

1 引言

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)，作為東海重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類和大型海洋污損生物[1]，具備較高的適應(yīng)外界環(huán)境和生存繁殖的能力。與大多數(shù)的海洋無脊椎動(dòng)物相同，厚殼貽貝的生活史中包括浮游生活和底棲附著兩部分。通常情況下，在變態(tài)發(fā)育前以浮游方式生存，后通過尋找合適的基質(zhì)進(jìn)行附著，變態(tài)發(fā)育為稚貝，并最終成長(zhǎng)為成貝[2]。在底棲附著階段，當(dāng)遇到不利于貽貝生長(zhǎng)生活的情況時(shí)，貽貝便將已形成的足絲切斷，離開原附著基質(zhì)，找尋更優(yōu)的基質(zhì)，通過形成新足絲再次附著[3]，這一過程即為二次附著。

影響厚殼貽貝稚貝附著的因素很多，已有研究發(fā)現(xiàn)[3?4]，無論是自然生物被膜還是單一細(xì)菌形成的生物被膜，對(duì)厚殼貽貝稚貝的附著都具有不同程度的誘導(dǎo)活性。在厚殼貽貝生長(zhǎng)發(fā)育過程中的幼蟲、稚貝階段，不同的海洋細(xì)菌形成的生物被膜所起到的作用也存在差異[5?6]。例如，細(xì)菌的一些胞外產(chǎn)物如纖維素[7]、膿黑素[8]的過量表達(dá)會(huì)顯著降低厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率。生物被膜作為一種廣泛存在的生命模式，在動(dòng)態(tài)演替的過程中，其細(xì)菌密度、膜厚、群落結(jié)構(gòu)及胞外產(chǎn)物的種類、含量等都對(duì)貽貝的附著有一定影響。

鞭毛作為原核生物的運(yùn)動(dòng)器官，不僅影響著其運(yùn)動(dòng)能力，還參與很多微生物的生理活動(dòng)過程，如生物被膜的形成[9]。而作為構(gòu)成細(xì)菌鞭毛主要物質(zhì)的鞭毛蛋白，也是細(xì)菌生物被膜重要的胞外產(chǎn)物。已有研究發(fā)現(xiàn)[10]，一定濃度的鞭毛蛋白可以直接誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)，鞭毛合成蛋白fliP基因的缺失會(huì)導(dǎo)致鞭毛結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)性喪失，生物被膜上胞外產(chǎn)物的含量發(fā)生改變，從而間接降低了幼蟲的附著變態(tài)率。鞭毛蛋白對(duì)厚殼貽貝稚貝的二次附著的作用尚未可知。為了探究這一問題，本研究通過采用酸解超速離心法獲得了海假交替單胞菌的鞭毛蛋白提取物，檢測(cè)了其對(duì)生物被膜生物學(xué)特性的影響。同時(shí)，使用瓊脂糖作為中間介質(zhì)測(cè)定了提取的鞭毛蛋白對(duì)厚殼貽貝稚貝附著的作用，旨在為探究細(xì)菌鞭毛蛋白與厚殼貽貝附著互作機(jī)制提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 厚殼貽貝稚貝、海洋細(xì)菌、鞭毛蛋白

本研究所用到的厚殼貽貝稚貝（殼長(zhǎng)為（0.64±0.018 ）mm；殼高為（0.44 ±0.015 ）mm）由浙江省嵊泗縣東海貽貝科技創(chuàng)新服務(wù)有限公司提供。稚貝首先進(jìn)行為期1周的暫養(yǎng)，暫養(yǎng)水溫為18℃，充氧氣，用湛江等鞭金藻進(jìn)行喂食，每天換水1次。所用的海假交替單胞菌（Pseudoalteromonasmarina）是從自然的生物被膜上得到，存于?80℃冰箱，在液體培養(yǎng)基（Zobell 2216E）中培養(yǎng)，設(shè)定溫度為25℃。所用的鞭毛蛋白通過酸解超速離心法從P.marina菌體中獲得。

2.1.2 主要試劑和儀器

Zobell2216E液體培養(yǎng)基、瓊脂糖、硫酸銨、BCA試劑盒、無菌玻璃載玻片（以上均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司）、奧林巴斯顯微鏡、冷凍離心機(jī)（5810 R,eppendorf）、恒溫?fù)u床(ZWYR-2012)。

2.2 方法

2.2.1 鞭毛蛋白的提取

鞭毛蛋白的提取參考Ibrahim等[11]介紹的方法，具體步驟是：將P.marina菌種接種于含有Zobell 2216E液體培養(yǎng)基（1 000 m L）的搖瓶中，在溫度為25℃，80 r/m in條件下振蕩培養(yǎng)18 h，再以4 000 r/m in的轉(zhuǎn)速離心15m in，收集細(xì)菌沉淀，用滅菌海水洗滌沉淀3次，目的是洗去菌體胞外產(chǎn)物。用滅菌的生理鹽水溶解細(xì)菌后滴加HCl（1 mol/L），使溶液pH調(diào)節(jié)為2.0。在常溫下進(jìn)行磁力攪拌，離心（5 000 g，30min）后取上清，再次離心（100 000 g，lh），保留上清，滴加NaOH（1 mol/L）使上清pH達(dá)到7.2，依據(jù)上清體積來添加(NH4)2SO4，調(diào)節(jié)上清濃度，使?jié)舛冗_(dá)2.67 mol/L。添加的(NH4)2SO4通過攪拌溶解，4℃保存溶液至過夜，4℃、15 000 g條件下離心15m in，棄上清，將沉淀放入5m L滅菌蒸餾水中使其完全溶解。再將溶解液加到準(zhǔn)備好的透析袋中，處理2 h。準(zhǔn)備滅菌的蒸餾水，加入活性炭（約20 g），將透析袋放置其中，4℃條件下攪拌18 h。最后將提取出來的鞭毛蛋白于?20℃條件下保存。

2.2.2 鞭毛蛋白SDS-PAGE及其濃度的測(cè)定

電泳載體為濃縮膠和分離膠（濃縮膠在上，分離膠在下），染色液為考馬斯亮藍(lán)，參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行操作。通過BCA法檢測(cè)鞭毛蛋白濃度，依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

2.2.3 鞭毛蛋白質(zhì)譜分析鑒定

提取的鞭毛蛋白質(zhì)譜分析鑒定由上海易算生物科技有限公司完成。詳細(xì)流程如下：

（1）將濃縮膠用水沖洗干凈后，切下被濃縮聚集的樣品條帶，切成1mm見方的小片，裝于EP管內(nèi)。加入適當(dāng)體積的純乙腈干膠后，再加入約50μL DTT溶液（濃度為10mmol/L，溶于100mmol/L碳酸氫銨中）將干膠粒全部覆蓋。于56℃下反應(yīng)半小時(shí)，冷卻至室溫后加入純乙腈干膠，棄去所有溶劑。隨后加入約50 μL IAA溶液（濃度為55 mmol/L，溶于100 mmol/L碳酸氫銨中）將干膠粒覆蓋，在37℃下于黑暗中反應(yīng)10m in，冷卻至室溫后加入純乙腈干膠，棄去所有溶劑。膠粒上的考馬斯亮藍(lán)染色劑用50%乙腈、50%100mmol/L碳酸氫銨溶液除去。脫色后加入純乙腈干膠，棄去樣品管中的溶劑，之后加入足夠體積的胰酶溶液（濃度為13 ng/μL，溶于含10%乙腈的10 mmol/L碳酸氫銨溶液中）進(jìn)行過夜酶解。酶解完畢，依次加入含0.1 %甲酸的5 0%乙腈溶液，含0.1 %甲酸的80%乙腈溶液以及純乙腈溶液將肽段從膠粒從萃取出來，合并后凍干。

（2）將再次溶于水中的樣品通過nano-HPLC-MS/MS進(jìn)行分析。質(zhì)譜儀可選定模式工作，在MS和MS/MS采集間自主轉(zhuǎn)變。

（3）串聯(lián)質(zhì)譜圖通過PEAKSStudio X分析。蛋白卡值為?10lgP≥20；肽段卡值為?10lgP≥20。

（4）氨基酸序列比對(duì)所用到的原始數(shù)據(jù)由P.marina基因組[13]查找到的細(xì)菌菌體鞭毛外部結(jié)構(gòu)相關(guān)的10個(gè)基因（包括1-fliC,2-fliC,3-fliC,4-fliC,fliD,flgL,flgK,flgE,fliK,flgD）在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中得到。

2.2.4 鞭毛蛋白對(duì)厚殼貽貝稚貝附著實(shí)驗(yàn)

將鞭毛蛋白與0.4%的瓊脂糖凝膠溶液（短暫冷卻至室溫）混合，為了獲得鞭毛蛋白對(duì)稚貝附著影響的合適濃度，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了鞭毛蛋白濃度梯度實(shí)驗(yàn)，即調(diào)整鞭毛蛋白終濃度為0.01 mg/L、0.1 mg/L、1.0 mg/L、10mg/L和20 mg/L。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，把鞭毛蛋白與瓊脂糖凝膠溶液混合液等量、均勻地滴加在無菌載玻片上至完全覆蓋載玻片（每張載玻片含1 m L混合液），無菌條件下室溫冷凝。玻璃培養(yǎng)皿經(jīng)高溫滅菌冷卻后，放入處理后的載玻片，再慢慢加入20 m L滅菌海水和10只稚貝，然后將其放入恒溫的18℃無光照培養(yǎng)室中，記錄12 h、24 h、48 h時(shí)稚貝在載玻片上的附著率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度分別設(shè)置9個(gè)平行組，對(duì)照組為無菌空載玻片和涂有單一成分的瓊脂糖凝膠，也分別設(shè)置9個(gè)平行組。參照楊金龍等[14]的計(jì)算方法進(jìn)行附著率的計(jì)算，并判定誘導(dǎo)能力的高低。

2.2.5 單一細(xì)菌生物被膜形成

參照楊金龍等[14]的方法制備生物被膜，首先，取?80℃保存的P.marina菌種進(jìn)行劃線，25℃培養(yǎng)過夜，挑選單一菌落到液體培養(yǎng)基中（收集菌體用2216E液體培養(yǎng)基），在25℃條件下震蕩培養(yǎng)2 d。菌體用滅菌海水重復(fù)重懸離心（3 500 r/min離心15 min）后洗3次，最后用50m L滅菌海水懸浮菌體，計(jì)算出細(xì)菌密度。將菌液轉(zhuǎn)移至無菌含有載玻片（38mm×26mm）的培養(yǎng)皿中，加入滅菌海水定容至20 m L，并調(diào)整菌液終密度（1.0×108cells/m L）。18℃條件下避光培養(yǎng)2 d，使菌體附著于載玻片上，實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組和該菌株的初始密度下分別設(shè)置9個(gè)平行。

2.2.6P.marina與鞭毛蛋白共同形成生物被膜

取無菌載玻片，先放入經(jīng)高溫滅菌后的培養(yǎng)皿中，加入一定量的清洗后的菌體懸浮液和鞭毛蛋白溶液，最后加入適量的滅菌海水定容至20m L，調(diào)整后使該株細(xì)菌的初始密度為1.0×108cells/m L，鞭毛蛋白的終濃度為10 mg/L，實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組均設(shè)置9個(gè)平行，18℃恒溫條件下避光培養(yǎng)2 d。

2.2.7 鞭毛蛋白處理P.marina生物被膜

P.marina單一生物被膜形成后，將形成生物被膜的載玻片在滅菌海水中輕輕潤(rùn)洗3次，然后放入無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加入適量的滅菌海水定容至20 m L，并加入鞭毛蛋白調(diào)整終濃度為10mg/L，本處理實(shí)驗(yàn)設(shè)置9個(gè)平行組，18℃恒溫條件下避光處理2 h。

2.2.8 處理后的生物被膜稚貝附著實(shí)驗(yàn)

將P.marina單一生物被膜和經(jīng)過鞭毛蛋白以2種方式處理后的生物被膜的載玻片放入經(jīng)高溫滅菌后的玻璃培養(yǎng)皿中，皿中加入滅菌海水（20m L）、稚貝（10只），于18℃避光培養(yǎng)后，分別記錄在6 h、12 h、24 h、48 h時(shí)的附著只數(shù)，設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)9組；無生物被膜的滅菌玻璃載玻片為對(duì)照組。參照文獻(xiàn)[14]的計(jì)算方法進(jìn)行附著率的計(jì)算，并判定誘導(dǎo)能力的高低。

2.2.9 生物被膜上細(xì)菌密度計(jì)數(shù)

將生物被膜用甲醛溶液（5%）處理24 h，吖啶橙（0.1%）染色5 m in后，將染色后的被膜在顯微鏡下觀察，找出任意10個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，設(shè)置3個(gè)平行，從而確定出生物被膜上細(xì)菌的最終密度，有關(guān)計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[14]。

2.2.10 生物被膜共聚焦掃描

將生物被膜用甲醛溶液（5%）浸泡24 h，遮光條件下用碘化丙啶（濃度為5μg/m L）進(jìn)行染色，再使用萊卡激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）在630×放大倍率下進(jìn)行觀察拍攝。每組生物被膜分別選取3個(gè)載玻片，每個(gè)載玻片上拍攝3個(gè)視野，即每組載玻片共掃描拍攝9個(gè)視野進(jìn)行成像觀察及胞外產(chǎn)物生物量數(shù)據(jù)比較分析。

2.2.11 生物被膜胞外α-多糖、β-多糖、蛋白、脂類染色實(shí)驗(yàn)

用相對(duì)應(yīng)的染料分別對(duì)生物被膜進(jìn)行胞外產(chǎn)物染色，處理后在萊卡激光共聚焦掃描顯微鏡下進(jìn)行拍照成像，方法參考文獻(xiàn)[15]。

2.2.12 數(shù)據(jù)處理

使用JMP軟件（版本10.0.0）進(jìn)行差異性分析，生物被膜上α-多糖、β-多糖、蛋白和脂類含量圖片處理使用ImageJ軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 鞭毛蛋白的提取及濃度的測(cè)定

本研究采用酸解超速離心法提取鞭毛蛋白，BCA法測(cè)得鞭毛蛋白濃度為0.926 mg/m L，于4℃保存。

3.2 鞭毛蛋白SDS-PAGE結(jié)果驗(yàn)證和質(zhì)譜分析鑒定

本實(shí)驗(yàn)SDS-PAGE中鞭毛提取物的上樣量為5μg，蛋白凝膠結(jié)果顯示出A、B兩條蛋白條帶，凝膠成像軟件系統(tǒng)分析A、B蛋白分子量分別約35 kDa和27 kDa （圖1）。

圖1 鞭毛蛋白SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 The SDS-PAGE of flagellin

提取的蛋白通過質(zhì)譜分析鑒定，結(jié)果如表1 所示。蛋白條帶A的氨基酸序列與fliC基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)翻譯得到的氨基酸序列相似度最高達(dá)61%，與另外幾個(gè)fliC蛋白亞基的氨基酸序列相似度分別為56%和55%；蛋白條帶B的氨基酸序列與fliC基因的氨基酸序列相似度達(dá)42%和39%。SDS-PAGE及質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，酸解超速離心法所獲得的蛋白為P.marina的fliC鞭毛蛋白混合物。

表1 P.marina細(xì)菌鞭毛蛋白質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果Table1 Themassspectrometry identification of flagellin extracted from P.marina

3.3 鞭毛蛋白對(duì)稚貝附著的影響

不同濃度下的鞭毛蛋白在不同時(shí)間段內(nèi)對(duì)稚貝附著的影響無明顯差異，選取培養(yǎng)時(shí)間為12 h的處理組為研究對(duì)象，結(jié)果見圖2。與空白組和涂有單一成分的瓊脂糖凝膠的稚貝誘導(dǎo)活性相比，滴加濃度為10mg/L、20mg/L的鞭毛蛋白的瓊脂糖凝膠載玻片對(duì)稚貝的附著的誘導(dǎo)活性顯著增加（p<0.05），且實(shí)驗(yàn)中稚貝無死亡情況。

圖2 鞭毛蛋白對(duì)稚貝附著的影響Fig.2 Effectsof settlement of M.coruscus plantigradeson the flagellin

3.4 鞭毛蛋白和P. marina共同形成的生物被膜及鞭毛蛋白處理P.marina細(xì)菌生物被膜對(duì)稚貝附著的影響

選取對(duì)稚貝附著率較高的鞭毛蛋白（10mg/L）與P.marina共同形成生物被膜和添加了相同濃度鞭毛蛋白2 h后的P.marina生物被膜，與單一細(xì)菌生物被膜對(duì)厚殼貽貝稚貝附著率相比，結(jié)果表明，2種方式均能顯著提高厚殼貽貝稚貝的誘導(dǎo)活性，且這2種處理方式對(duì)稚貝附著的影響無明顯差異（p>0.05）（圖3 A）。

通過對(duì)生物被膜上細(xì)菌密度的計(jì)數(shù)與分析發(fā)現(xiàn)，與單一細(xì)菌生物被膜相比較，鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜上細(xì)菌密度顯著增大(p<0.05)，而用鞭毛蛋白處理的細(xì)菌生物被膜細(xì)菌密度無變化（圖3 B）。

圖3 不同處理方式形成的生物被膜對(duì)稚貝附著的影響及細(xì)菌密度的分析Fig.3 Influence of biofilms formed by different treatments on the settlement of plantigradesand the analysisof bacterialdensity

3.5 鞭毛蛋白對(duì)P.marina生物被膜上細(xì)菌分布狀態(tài)和生物被膜膜厚的影響

鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜和鞭毛蛋白處理P.marina細(xì)菌生物被膜后生物被膜上細(xì)菌分布狀態(tài)。P.marina單一生物被膜上細(xì)菌分布均勻，呈單個(gè)菌體狀態(tài)（圖4 A），與對(duì)照組P.marina單一生物被膜相比較，鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜上細(xì)菌菌體聚集程度較高，細(xì)菌菌體聚集成堆，使膜厚增加，細(xì)菌密度增大（圖4 B）；而鞭毛蛋白處理的P.marina細(xì)菌生物被膜上細(xì)菌分布狀態(tài)和膜厚無明顯變化（圖4 C）。

圖4 激光共聚焦掃描顯微鏡下鞭毛蛋白對(duì)P.marina 生物被膜上細(xì)菌分布與聚集狀態(tài)的影響以及鞭毛蛋白對(duì)P.marina生物被膜膜厚膜厚的影響Fig.4 Effect of flagellin on the distribution and aggregation of bacteria on P.marina biofilm by laser confocal scanning microscopy and the effect of flagellin on thickness of P.marina biofilm

3.6 鞭毛蛋白對(duì)P. marina 生物被膜上α-多糖、β-多糖、蛋白和脂類含量的影響及差異分析

P.marina單一生物被膜、鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜和鞭毛蛋白處理P.marina細(xì)菌生物被膜后胞外產(chǎn)物中的α-多糖、β-多糖、蛋白和脂類含量染色結(jié)果及含量差異性分析結(jié)果如圖5 A和圖5 B所示。對(duì)于α-多糖含量變化的比較，相比較P.marina單一生物被膜，鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜上α-多糖含量呈顯著性增加(p<0.05)，鞭毛蛋白處理P.marina細(xì)菌生物被膜上α-多糖含量無顯著性變化，而鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜與鞭毛蛋白處理P.marina細(xì)菌生物被膜相比較，二者膜上α-多糖含量無顯著性差異；對(duì)于β-多糖含量變化的比較，相比較P.marina單一生物被膜，鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜上β-多糖含量呈顯著性增加(p<0.05)，而鞭毛蛋白處理P.marina細(xì)菌生物被膜上β-多糖含量無變化，相比較鞭毛蛋白處理P.marina細(xì)菌生物被膜，鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜胞外β-多糖含量呈顯著性增加(p<0.05)；對(duì)于蛋白含量變化的比較，相比較P.marina單一生物被膜，鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜和鞭毛蛋白處理P.marina細(xì)菌生物被膜這2種方式，其胞外蛋白含量呈極其顯著性增加(p<0.01)，而這2種方式比較其胞外蛋白含量無顯著性變化；對(duì)于脂類含量變化的比較，相比較P.marina單一生物被膜，鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜上脂類含量呈顯著性增加，而鞭毛蛋白處理P.marina細(xì)菌生物被膜上脂類含量無顯著變化，與鞭毛蛋白處理P.marina細(xì)菌生物被膜相比，鞭毛蛋白與P.marina共同形成生物被膜上胞外脂類含量呈顯著性增加(p<0.05)。

圖5 胞外產(chǎn)物含量Fig.5 The extracellular polymeric substance

4 結(jié)論與討論

在海洋中生活著許多微生物，其形成的生物被膜可以影響海洋無脊椎動(dòng)物幼蟲附著變態(tài)[16]。根據(jù)Yang等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，被膜上胞外產(chǎn)物如多糖、蛋白、脂類能夠促進(jìn)厚殼貽貝稚貝的附著，胞外產(chǎn)物含量的變化會(huì)對(duì)厚殼貽貝稚貝的附著造成影響。本實(shí)驗(yàn)選取了對(duì)厚殼貽貝稚貝附著具有較高誘導(dǎo)活性的海洋細(xì)菌P.marina，采用酸解超速離心法提取P.marina的鞭毛蛋白，探究了鞭毛蛋白是直接影響海洋無脊椎動(dòng)物附著，或是通過調(diào)控細(xì)菌生物被膜在形成過程中的生物量和胞外產(chǎn)物以及生物被膜這些生物學(xué)特性的改變來影響海洋無脊椎動(dòng)物附著。

4.1 提取的鞭毛蛋白對(duì)稚貝附著的影響

SDS-PAGE蛋白凝膠結(jié)果顯示出兩條蛋白條帶，大小分別約35 kDa和27 kDa，與在P.marina基因組[13]中查到的鞭毛蛋白基因fliC條帶相吻合（鞭毛蛋白基因fliC有4個(gè)亞型，其中3個(gè)亞型對(duì)應(yīng)的蛋白分子量大小均為34 kDa左右，另一個(gè)亞型對(duì)應(yīng)的蛋白分子量為27.21 kDa）。證明本研究所提取到的鞭毛蛋白為P.marina的fliC鞭毛蛋白混合物。而顏成英等[17]從鼠傷寒沙門氏菌中所提取的鞭毛蛋白只有單一條帶，分子量大小為57 kDa，推測(cè)可能是由于菌株結(jié)構(gòu)不同而產(chǎn)生了差異。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，把P.marina鞭毛蛋白與0.4%的瓊脂糖溶液混合滴加到玻璃載玻片冷凝后可形成混合凝膠，當(dāng)添加的鞭毛蛋白終濃度大于10mg/L時(shí)，能顯著促進(jìn)厚殼貽貝稚貝的附著。將涂有單一成分的瓊脂糖凝膠組與空白對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)稚貝的誘導(dǎo)活性無顯著差異（p>0.05）。這表明，瓊脂糖作為一種載體，自身對(duì)稚貝附著是沒有影響的，是一種理想的實(shí)驗(yàn)材料，將鞭毛蛋白與瓊脂糖凝膠混合的這一實(shí)驗(yàn)方法具有可行性與普適性。

之前有研究表明[10]，細(xì)菌鞭毛蛋白可以誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)，當(dāng)鞭毛蛋白濃度為1mg/L時(shí)，誘導(dǎo)活性最高，且當(dāng)把鞭毛蛋白回補(bǔ)到缺失鞭毛蛋白基因的突變菌中后，其對(duì)幼蟲附著的誘導(dǎo)活性可恢復(fù)到與野生菌同樣的效果。隨著加入的鞭毛蛋白濃度增高，厚殼貽貝幼蟲出現(xiàn)了死亡情況。推測(cè)可能由于鞭毛蛋白也是一種毒力因子，顯現(xiàn)出致病性，過量的鞭毛蛋白加劇了對(duì)幼蟲的黏附與侵襲，導(dǎo)致了幼蟲的死亡。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)加入的鞭毛蛋白濃度高達(dá)到20mg/L時(shí)，稚貝仍無死亡情況。我們推測(cè)，可能是厚殼貽貝的幼蟲與稚貝對(duì)鞭毛蛋白毒力的抗性不同所導(dǎo)致。這也進(jìn)一步表明，雖然鞭毛蛋白可以調(diào)控厚殼貽貝的幼蟲、稚貝的附著，且這種調(diào)控作用具有濃度依賴性，但其作用的機(jī)制存在差異。

4.2 鞭毛蛋白對(duì)生物被膜形成的影響

細(xì)菌鞭毛作為運(yùn)動(dòng)器官，具有運(yùn)動(dòng)性和趨化性，對(duì)后續(xù)生物被膜形成及宿主與環(huán)境間信號(hào)傳導(dǎo)也有重要的影響[18]。本研究通過分析被膜的生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，與野生型單一生物被膜相比，鞭毛蛋白與細(xì)菌共同形成的被膜上細(xì)菌生物量明顯升高，細(xì)菌聚集成堆，以致于膜上細(xì)菌密度增大，膜厚增加；而將鞭毛蛋白滴加到已形成的生物被膜上室溫靜置1～2 h后，其膜上細(xì)菌密度、膜厚均無顯著性變化。根據(jù)Pratt和Kolter[19]所提出的膜形成初始模型來看，可能是由于鞭毛蛋白在與細(xì)菌共同形成被膜的過程中，其介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性與趨化性使細(xì)菌可以更快到達(dá)附著基質(zhì)表面，同時(shí)使游離的細(xì)胞不斷聚集。成膜過程中，鞭毛蛋白也進(jìn)一步協(xié)助細(xì)菌擴(kuò)散，從而促進(jìn)了膜長(zhǎng)延伸、膜厚增加。而將鞭毛蛋白滴加到已形成的被膜上的短暫處理，未能達(dá)到上述作用。但在Kim等[20]構(gòu)建的關(guān)于Yersinia enterocolitica突變體研究中發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)性與生物被膜的形成二者間并非一個(gè)絕對(duì)的正比關(guān)系。推測(cè)運(yùn)動(dòng)性在被膜的形成中起重要作用但不是決定性作用。也有研究表明[7,21?22]，纖維素、多糖、蛋白等胞外產(chǎn)物對(duì)被膜的形成也具有重要影響。

本研究通過與單一的被膜相比，發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白與細(xì)菌共同形成的生物被膜上多糖、蛋白、脂的含量都有顯著增加，而滴加鞭毛蛋白溶液處理的生物被膜上多糖和脂質(zhì)均無顯著性變化，僅胞外蛋白含量顯著性增加。我們推測(cè)，增加的蛋白可能僅是實(shí)驗(yàn)中添加的鞭毛蛋白而非其他胞外蛋白產(chǎn)物。這一結(jié)果表明，鞭毛蛋白不僅對(duì)生物被膜的形成起促進(jìn)作用，還可以提高其生物學(xué)特性；而將鞭毛蛋白滴加到已形成的生物被膜上并不會(huì)改變被膜的生物學(xué)特性。這對(duì)于后續(xù)選擇性培養(yǎng)人工被膜和胞外產(chǎn)物的定量有一定指導(dǎo)意義。

4.3 鞭毛蛋白處理后的生物被膜對(duì)稚貝附著的影響

鞭毛蛋白處理后的生物被膜除了胞外產(chǎn)物及生物學(xué)特性發(fā)生了變化外，其功能性也隨之改變。在進(jìn)行稚貝附著實(shí)驗(yàn)時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白無論是在生物被膜形成前或形成后加入對(duì)稚貝的誘導(dǎo)活性均顯著提高，稚貝附著率高達(dá)60%。表明這2種不同的處理方式都可提高厚殼貽貝稚貝的附著。

但是通過共聚焦圖像分析發(fā)現(xiàn)，鞭毛蛋白與P.marina共同形成的被膜，其胞外多糖、脂的含量都明顯高于將鞭毛蛋白滴加到已形成的被膜上。推測(cè)鞭毛蛋白也參與調(diào)控了被膜形成的過程，促進(jìn)了胞外產(chǎn)物的分泌。而胞外多糖、蛋白等含量的增加也進(jìn)一步促進(jìn)了稚貝的附著。

對(duì)在已形成的被膜上添加鞭毛蛋白的分析發(fā)現(xiàn)，其胞外產(chǎn)物僅有蛋白含量增加，推測(cè)是由于添加了鞭毛蛋白，從而引起稚貝的附著率的隨之升高。這一結(jié)果也間接證明了細(xì)菌鞭毛蛋白具有直接調(diào)控厚殼貽貝稚貝附著的作用。

之前的研究表明，很多胞外產(chǎn)物可以調(diào)控海洋無脊椎動(dòng)物的附著變態(tài)，如纖維素處理后的生物被膜胞外多糖、脂含量減少，對(duì)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的誘導(dǎo)活性降低[23]；P.marina鞭毛蛋白fliP缺失的突變菌所形成的生物被膜胞外β-多糖減少，使厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率降低[10]。在本研究中，鞭毛蛋白在與P.marina共同形成被膜的過程中，除了使胞外多糖含量上升，還進(jìn)一步調(diào)控了胞外脂質(zhì)的增加，進(jìn)而影響厚殼貽貝稚貝的二次附著。推測(cè)可能在厚殼貽貝生長(zhǎng)發(fā)育過程中幼蟲和稚貝的2種附著機(jī)理之間存在差異，關(guān)于其中具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，從廣泛存在于海洋環(huán)境中的P.marina中提取的鞭毛蛋白可以直接促進(jìn)厚殼貽貝稚貝的附著，也能通過改變生物被膜的形成及生物學(xué)特性，間接影響稚貝附著。在厚殼貽貝附著過程中，鞭毛蛋白通過調(diào)控多糖、脂等不同的胞外產(chǎn)物來影響厚殼貽貝稚貝的二次附著。從附著結(jié)果來看，不同方式添加的鞭毛蛋白對(duì)稚貝附著具有同樣作用，但對(duì)內(nèi)在的生物被膜的形成與胞外產(chǎn)物的分泌還是有不同的影響。這也表明，厚殼貽貝的附著受多種因素調(diào)控，不是單一因素決定，胞外產(chǎn)物在生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段發(fā)揮不同作用，在與宿主信息交流、物質(zhì)傳遞方面可能存在逐級(jí)調(diào)控關(guān)系。本研究的結(jié)果為探索厚殼貽貝稚貝附著的調(diào)控機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)，為解決海洋污損問題，改善無脊椎動(dòng)物與海洋環(huán)境關(guān)系以及研究海洋微生物與其宿主的相互作用提供新的研究思路。