動(dòng)脈球囊損傷大鼠Akt、GSK-3β表達(dá)及藥物干預(yù)治療

葛 華,潘龍慶,王天如,王 月,李立杰,周雪瑩

0 引言

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)是目前治療冠心病最為有效的方法之一。由于患者術(shù)后再狹窄的發(fā)生率高，嚴(yán)重影響了PCI的臨床療效。最初的球囊擴(kuò)張術(shù)再狹窄率達(dá)到35%～50%[1]，隨著金屬裸支架及藥物涂層支架的應(yīng)用，再狹窄率有所下降[2]。因此，再狹窄的防治成為目前心血管領(lǐng)域防治研究的重要課題。研究證實(shí)，血管內(nèi)皮損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞的增生移植是發(fā)生PCI術(shù)后再狹窄的重要病理生理基礎(chǔ)[3]。厄貝沙坦是一種血管緊張素II受體拮抗劑(Angiotensin Ⅱ receptor blocker,ARB)，在逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)、降壓等方面發(fā)揮重要作用。近年來(lái)的研究證實(shí)，ARB有抑制血管平滑肌增殖的作用[4]。

本研究以蛋白激酶B (Protein Kinase B,也稱Akt)結(jié)合糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)為上、下游信號(hào)分子，研究再狹窄的發(fā)生機(jī)制，探討厄貝沙坦與Akt、GSK-3β信號(hào)通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞增生中的相互關(guān)系，探析再狹窄信號(hào)通路的作用，為臨床藥物的治療機(jī)制開拓新思路。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠48只，體重300～350 g,由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.2 方法 按照 Deman 等方法制備大鼠動(dòng)脈血管形成術(shù)模型，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，消毒右側(cè)腹股溝區(qū)，剪開皮膚及皮下組織，鈍性分離肌層，暴露股動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用動(dòng)脈夾夾閉，在結(jié)扎線上方剪一個(gè)J字口，插入自制 2F Forgraty 球囊導(dǎo)管，松開動(dòng)脈夾，進(jìn)入球囊約12 cm,插入至胸主動(dòng)脈，肝素生理鹽水充盈球囊，回拉球囊，在3個(gè)相隔120°的方向上各重復(fù)3次，拔出球囊導(dǎo)管，近心端結(jié)扎，逐層縫合，消毒。術(shù)后隨機(jī)分為模型組、藥物組，每組16只。厄貝沙坦50 mg/(kg·d) 溶于生理鹽水，采取胃管給藥，每日1次。模型組及對(duì)照組(n=16)予等量生理鹽水灌胃。分別于第2周和第4周處死大鼠取材。

1.3 標(biāo)本采集及處理 以10%KCl 2～3 ml 股靜脈注射處死各觀察終點(diǎn)大鼠，分離血管，于4%福爾馬林固定24 h，取長(zhǎng)約1～1.5 mm 的血管切片，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋。

1.4 Western blot測(cè)定Akt、GSK-3β蛋白水平表達(dá) 血管組織于冷凍的提取緩沖液(1∶3wt/vol) (成分：10 mM Tris HCl,pH7.5,140 mM NaC1,1 mM EDTA,25%Glvcerol,0.5%SDS,0.5% Nonidentp-40,0.1 mM PMSF,100 ng/ml Protease inhibitor cocktail)中行均質(zhì)化處理(30 s.2 000 r/min),離心(4 ℃,10 min,14 000 r/min),Bio-Rad 蛋白分析儀(Bio-Rad company,USA) 測(cè)量上清液蛋白濃度，液氨速凍保存于-80 ℃。10%SDS-PAGE 分離10～20 μg蛋白于硝酸纖維素膜行蛋白印跡雜交。GSK-3β抗體(FabGennix) 、Phospho-ser473-AKT 和 AKT 抗體(New England Biolabs) 按說(shuō)明書方法檢測(cè)。應(yīng)用二抗特異性 HRP-conjugated 抗體，其信號(hào)用 ECL detection kit (Amersham Pharmacia Biotech) 顯示，AlphaEaseFC Software 處理并量化統(tǒng)計(jì)。為標(biāo)準(zhǔn)化不同的蛋白含量，利用剝脫液(stripping buffer:1.87 g glycin/1 L,100 ml 10%SDS/1 L,pH=2) 剝脫原始抗體復(fù)合物,并用GAPDH (primary antibody:Chemicon,MAB-374,1∶5 000;secondary antibody:Donkey anti-mouse,Dianova,1∶50 000)再雜交內(nèi)對(duì)照。

2 結(jié)果

動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后2周和4周，手術(shù)組血管組織的Akt表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高，GSK-3β表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；厄貝沙坦治療組Akt表達(dá)量較手術(shù)組明顯降低，GSK-3β表達(dá)量較手術(shù)組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、表2。

表1 各組大鼠成模后2周血管組織中Akt、GSK-3β蛋白表達(dá)比較

表2 各組大鼠成模后4周血管組織中Akt、GSK-3β蛋白表達(dá)比較

3 討論

PCI術(shù)后再狹窄是多種因素綜合導(dǎo)致的，主要有冠脈彈性回縮、血管重塑、血栓的形成、血管平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增生及遷移[5]。植入支架可以干預(yù)彈性回縮、影響血管重塑，但不能抑制血栓形成及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是術(shù)后再狹窄形成的主要機(jī)制[6]。手術(shù)操作導(dǎo)致的血管內(nèi)膜機(jī)械性損傷會(huì)使脂質(zhì)、血小板及單核巨噬細(xì)胞等血液中的活性成分在損傷區(qū)域沉積，而且會(huì)引發(fā)血管平滑肌細(xì)胞的內(nèi)遷及增殖[7-8]。血管內(nèi)皮損傷后激活了大量的炎性細(xì)胞，聚集在損傷處并分泌出大量的生長(zhǎng)因子、炎性因子(如血小板源衍生生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、白介素-1、血栓素A2等)介導(dǎo)多個(gè)信號(hào)通路，參與了血管狹窄的過(guò)程[9]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶也具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用[10]。

本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠球囊損傷模型，發(fā)現(xiàn)術(shù)后血管組織中Akt表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高，GSK-3β表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低，提示GSK-3β可能是一種血管保護(hù)因子，而Akt可能是血管內(nèi)皮增生的獨(dú)立影響因子。應(yīng)用厄貝沙坦干預(yù)后，藥物組Akt表達(dá)量較模型組明顯降低，GSK-3β表達(dá)量較模型組明顯升高。結(jié)果表明，厄貝沙坦可能是通過(guò)激活A(yù)kt/GSK-3β信號(hào)通路從而參與抑制血管內(nèi)皮增生。

PI3K 在人體各種細(xì)胞中廣泛存在，是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要存在，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Akt是反轉(zhuǎn)錄病毒Akt-8 的癌基因 v-akt 編碼的產(chǎn)物，是PI3K 下游的最直接的信號(hào)分子。研究表明，Akt 被激活后，會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，磷酸化后激活下游信號(hào)靶點(diǎn)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，可以對(duì)心臟產(chǎn)生保護(hù)作用[11-12]。GSK-3β為一種絲氨酸/蘇氨酸酶，是Akt下游的一個(gè)直接作用底物。它在許多代謝和生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，已被證實(shí)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[13]，此外，GSK-3β還促進(jìn)cyclinD蛋白水解[14]。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路能夠通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和參與血管形成等多種機(jī)制影響心臟功能[15]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Akt能夠通過(guò)抑制GSK-3β的表達(dá)而增加cyclinD，并促使內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入增殖周期[16]。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)非常重要的生存通路，Akt信號(hào)通路能發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡的重要作用，在維持細(xì)胞生存中發(fā)揮重要作用[17]。厄貝沙坦是ARB類藥物，通過(guò)特異性拮抗轉(zhuǎn)換酶受體，抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，降低細(xì)胞氧化自由基的含量，發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定作用，還同時(shí)抑制醛固酮和血管收縮素的含量，從而抑制血管收縮、解決水鈉潴留[18]。有研究通過(guò)過(guò)度表達(dá)Notch1抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,同時(shí)發(fā)現(xiàn)AngII的表達(dá)減少[19]，表明厄貝沙坦有抑制血管內(nèi)膜損傷后的增生、降低術(shù)后再狹窄的作用[20]。

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在再狹窄中的作用越來(lái)越受到研究者的重視，本研究從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以Akt結(jié)合GSK-3β研究再狹窄的機(jī)制，為再狹窄防治提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，應(yīng)用厄貝沙坦干預(yù)治療使術(shù)后再狹窄患者的防治成為可能，具有較好的應(yīng)用前景。