基于GC-MS八角楓對(duì)大鼠的肝臟代謝組學(xué)研究

茅銀燕，江夏娟，仝淑花，林崇良*

0 引言

中藥材八角楓[Alangiumchinense(Lour.)Harmssubsp.Chinense]，來源于八角楓科(Alangiaceae)八角楓屬(Alangium)植物[1]，廣泛分布于中國南方地區(qū)。八角楓的根、根皮、葉、花、皮[2]等均可入藥，莖民間稱為白龍條，須根民間稱為白龍須，可用于治療風(fēng)濕、跌打損傷、外傷等[3-5]，臨床使用中主要以須根為主。中成藥制劑主要有風(fēng)濕定片、膠囊[6]等。八角楓是一種有毒的中藥材，毒藜?jí)A是八角楓的主要毒性成分，其中毒機(jī)制[7-9]為肌肉松弛作用和呼吸肌麻痹。本文應(yīng)用代謝組學(xué)方法，探究八角楓對(duì)肝臟代謝的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠，(200±20)g，32只大鼠均飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。動(dòng)物使用許可證號(hào)：WYDW2019-0983。

1.1.2 試劑與藥品 三甲基氯硅烷(TMCS)、N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)、甲基羥基胺鹽酸鹽和吡啶(純度>98%)購自美國Sigma公司。HPLC級(jí)乙腈和正庚烷購自美國Merck公司。八角楓采自浙江省永嘉縣，經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院林崇良副主任中藥師鑒定為八角楓。取其須根20 g，加水200 ml，常壓下100 ℃水煎煮30 min，過濾，制備成八角楓煎煮液備用，0.1 g/ml。八角楓煎煮液經(jīng)處理后UPLC-MS/MS定量檢測(cè)，含有毒藜?jí)A39.5 μg/ml和水楊苷12.5 μg/ml。

1.1.3 儀器 GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜儀型號(hào)為6890N-5975B(美國Agilent公司)。色譜柱為HP-5 MS(0.25 mm×30 m，0.25 μm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 八角楓藥材分須根(直徑1 mm)、粗根(支根或側(cè)根，直徑3～5 mm)，須根毒性強(qiáng)，粗根毒性稍弱，主要有效成分為毒藜?jí)A和水楊苷，水煎服成人用量為0.3～3 g，按比例換算大鼠每日劑量。將大鼠分為4組，每組8只。對(duì)應(yīng)劑量具體分為對(duì)照組和3個(gè)劑量組：八角楓低劑量組0.25 g/kg、中劑量組0.5 g/kg、高劑量組1.0 g/kg。對(duì)照組口服1 g/(kg·d)生理鹽水14 d；八角楓低劑量組0.25 g/(kg·d)，八角楓中劑量組0.5 g/(kg·d)，八角楓高劑量組1.0 g/(kg·d)，均口服給藥14 d。第15天上午8∶00收集四組大鼠肝樣本，儲(chǔ)存于-80 ℃直至測(cè)量。

1.2.2 樣品制備 將大鼠處死后收集肝組織研磨至勻漿。將400 μl乙腈加入到100 μl肝勻漿中，渦旋1 min，在4 ℃下以10 000 g持續(xù)離心10 min。取上清液300 μl轉(zhuǎn)移到離心管中，氮?dú)獯蹈?。再加入甲基羥胺鹽酸鹽(15 mg/ml吡啶溶液)50 μl，70 ℃甲肟化24 h。加入MSTFA(含1%TMCS作為催化劑)50 μl保持70 ℃ 1 h，加入150 μl正庚烷，離心取100 μl上清液保存，待測(cè)。

1.2.3 儀器條件 采用EI模式，在電子能量為70 eV、m/z50～550，使用全掃描模式，進(jìn)樣選擇不分流模式。柱溫箱的初始溫度設(shè)定在80 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min速度持續(xù)升溫至300 ℃，保持5 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析 SIMCA-P 13.0軟件(Umetrics，Umea，瑞典)，通過主成分分析(PCA)和PLS-DA處理由GC-MS所檢測(cè)的數(shù)據(jù)。根據(jù) SIMCA-P13.0軟件中正常組與模型組的變量權(quán)重(Variable importance in the projection，VIP)，篩選出 VIP>1的變量，進(jìn)一步行非參數(shù)檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 18.0軟件，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)檢測(cè)兩組間代謝物的差異，P<0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 代謝標(biāo)志物尋找及代謝通路分析 NIST2008標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，結(jié)合使用KEGG數(shù)據(jù)庫 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)確定相關(guān)代謝生物標(biāo)志物，導(dǎo)入MetaboAnalyst進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果

相同保留時(shí)間下，對(duì)照組與劑量組豐度差異明顯，血漿代謝物特征峰的保留時(shí)間和離子豐度值穩(wěn)定，這表明在數(shù)據(jù)采集過程中氣質(zhì)儀運(yùn)行穩(wěn)定可靠。

2.1 PCA與PLS-DA分析結(jié)果 從八角楓組3個(gè)劑量組與對(duì)照組大鼠PCA的比較結(jié)果可見，分離效果不理想，各組間有明顯的重疊，表明可能各組的肝臟代謝物難以明顯區(qū)分，PCA-2D R2Y=0.175，PCA-3D R2X=0.302，R2Y=0.175，如圖1所示。進(jìn)一步使用PLS-DA得分圖進(jìn)行分析。PLS-3D評(píng)分圖顯示，八角楓的3個(gè)劑量組與對(duì)照組分別可以明顯區(qū)分，且PLS-3D結(jié)果優(yōu)于PLS-DA，隨著劑量增加，在PLS-3D上位置也有不同程度偏移，PLS-2D R2Y=0.109，PLS-DA-3D R2X=0.235，R2Y=0.109，見圖2。

圖1 大鼠肝組織樣品的PCA評(píng)分結(jié)果

圖2 大鼠肝樣品的PLS-DA評(píng)分結(jié)果

2.2 代謝標(biāo)志物及其相對(duì)變化 圖3為肝組織的典型GC-MS代謝譜。NIST 2005數(shù)據(jù)庫檢索組織中的內(nèi)源性代謝物，共約90種小分子化合物，包括氨基酸類、有機(jī)酸類、脂肪酸類等，GC-MS方法學(xué)的重復(fù)性RSD小于15%[10]。

圖3 大鼠肝樣品的GC-MS圖

本研究使用PLS-DA模型中的變量重要性投影(VIP)參數(shù)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)內(nèi)源性代謝物相對(duì)峰面積在對(duì)照組和劑量組之間的差異。只有同時(shí)滿足VIP>1和P<0.05才被認(rèn)為可能是潛在的生物標(biāo)志物。按上述原則，共從八角楓對(duì)照組和3個(gè)不同劑量組的代謝產(chǎn)物的變化對(duì)照中，發(fā)現(xiàn)了12個(gè)內(nèi)源性生物標(biāo)志物，見表1。結(jié)果表明，八角楓組和對(duì)照組比較，N,N-二丁基乙酰胺(N,N-dibutyl-Acetamide)、甘油(Glycerol)、丙氨酸(Alanine)、木糖醇(Xylitol)、山梨醇(Glucitol)、9,12-十八碳二烯酸[(Z,Z)-9,12-Octadecadienoic acid]、4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)(4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid)、α-麥角甾烯醇(alpha.-Ergostenol)降低，絲氨酸(Serine)、磷酸(Phosphoric acid)、棕櫚酸(Hexadecanoic acid)、D-葡萄糖醛酸(D-Glucuronic acid)升高。

表1 大鼠給予八角楓后血漿中代謝物的相對(duì)水平

2.3 代謝通路圖的構(gòu)建 將得到的生物標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路分析，MetPA潛在目標(biāo)代謝途徑分析(影響值≥0.10)顯示，八角楓影響肝代謝紊亂最密切的6條代謝途徑是亞油酸途徑(Linoleic acid metabolism)、抗壞血酸和醛酸代謝(Ascorbate and aldarate metabolism)、糖醛酸途徑(Pentose and glucuronate interconversions)、甘油脂代謝(Glycerolipid metabolism)、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝(Glycine,serine and threonine metabolism)以及氨酰-tRNA合成(Aminoacyl-tRNA biosynthesis)，見表2。不飽和脂肪酸在體內(nèi)參與一系列氧化反應(yīng)，能量水平的變化直接影響正常的生理代謝，這也反映在了代謝途徑的變化中,表明八角楓可能導(dǎo)致機(jī)體糖脂代謝紊亂，主要是通過影響肝的脂質(zhì)過氧化、氧化應(yīng)激等途徑來參與肝代謝。

表2 代謝通路及影響值

3 討論

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，中草藥是安全有效的天然藥物，不良反應(yīng)比化學(xué)藥物小，但相比西藥，服用中草藥及相關(guān)制劑引起的藥物性肝損傷最為多發(fā)，而其中又以民間自用驗(yàn)方、單方制劑引起的藥物性肝損傷比例最高[11-12]。中藥成分繁多，藥理活性復(fù)雜，劑型、劑量、配伍變化多變，這導(dǎo)致其不良反應(yīng)難以預(yù)測(cè)且多發(fā)，也導(dǎo)致中藥臨床用藥安全越來越被廣泛關(guān)注。肝臟作為藥物代謝最重要的器官，同時(shí)也是毒性反應(yīng)最主要的靶器官，關(guān)于中藥引起肝損傷的臨床報(bào)道屢見不鮮。目前，有報(bào)道，引起肝臟損害的常用單味中草藥約有50多種[13]，而民間用藥品種更多且難以統(tǒng)計(jì)，中草藥引起肝損傷的成分主要以生物堿類為主，引發(fā)的肝損傷發(fā)病數(shù)和社會(huì)危害程度已經(jīng)成為不可忽視的問題[14]，這也嚴(yán)重限制了中醫(yī)藥的國際化發(fā)展。

張長銀等[8]通過觀察八角楓急性中毒小鼠，發(fā)現(xiàn)中毒小鼠的肝細(xì)胞水樣變性，病變部位以肝小葉為主，伴匯管區(qū)淤血和靜脈擴(kuò)張，說明肝臟是八角楓毒性作用的主要靶器官之一。八角楓的根皮、須根中含有水楊苷類、生物堿等物質(zhì)，須根含量較高，具備較好的抗炎止痛作用，具備一定的開發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值，在疼痛類疾病(如風(fēng)濕)的治療中顯效明顯，目前以民間自用較多。臨床上也曾用作肌松劑，但是由于八角楓的生物堿所含有的毒性，劑量不易控制，毒性較大，故逐漸被取代。臨床工作中偶可見到因自行服用八角楓后出現(xiàn)麻痹的患者，還有服用八角楓導(dǎo)致死亡的案例[15-16]，這些都極大地限制了八角楓的臨床應(yīng)用。

代謝組學(xué)是一種新的技術(shù)方法[17-18]，旨在研究生物系統(tǒng)(組織、器官、細(xì)胞模型或整個(gè)有機(jī)體)全部代謝物組成的功能和代謝，通過觀察生物系統(tǒng)受干擾或者刺激后的小分子代謝產(chǎn)物的改變來預(yù)測(cè)生物體系代謝途徑的改變。代謝組學(xué)非常適合中醫(yī)藥多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)特點(diǎn)的整體研究特點(diǎn)，通過借助現(xiàn)代化的科技和手段，動(dòng)態(tài)化監(jiān)測(cè)中草藥給藥后內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，以快速評(píng)價(jià)中藥毒性并分析其作用機(jī)制，尋找中藥肝損傷的早期生物標(biāo)志物、探討中藥的肝毒性機(jī)制。

質(zhì)譜廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究，最常用的是液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法。氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)用于樣品制備技術(shù)成熟，通過評(píng)估保留時(shí)間/索引和電子碰撞質(zhì)譜來識(shí)別代謝物能力強(qiáng)，這些優(yōu)點(diǎn)使其廣泛適用于代謝組學(xué)研究[19-20]。我們使用GC-MS技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法研究了八角楓誘導(dǎo)的小鼠的代謝輪廓，分離效果較為滿意。經(jīng)八角楓誘導(dǎo)的大鼠與對(duì)照組比較，許多代謝物的血漿水平發(fā)生了明顯變化，共篩選出12個(gè)內(nèi)源性生物標(biāo)志物。研究結(jié)果提示，在大鼠體內(nèi)已經(jīng)發(fā)生了糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝異常。不飽和脂肪酸能夠起到抗脂質(zhì)過氧化作用，減少脂質(zhì)過氧化對(duì)細(xì)胞的損傷，保護(hù)肝細(xì)胞的正常工作，一系列不飽和脂肪酸含量下降表明肝臟對(duì)炎癥的應(yīng)激反應(yīng)受到較大影響。糖類物質(zhì)作為最基本的供能物質(zhì)，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化過程被干擾導(dǎo)致能量供應(yīng)產(chǎn)生障礙。氨酰-tRNA途徑影響蛋白質(zhì)的合成，從而影響肝臟組織的穩(wěn)定分泌、酶合成、解毒等重要功能。這表明八角楓能夠在一定程度上誘導(dǎo)肝代謝紊亂，其機(jī)制可能是八角楓影響肝臟的脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、氨基酸代謝有關(guān)。本研究將基于GC-MS和多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)技術(shù)的代謝組學(xué)方法成功應(yīng)用于八角楓對(duì)大鼠肝代謝的研究。