免疫磁珠-高效液相色譜法測(cè)定虎杖中抑制前白蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草菌素9成分含量

劉興艷，涂家潔，朱承華，趙佳菲，張曉芝

（寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，浙江寧波 315800）

虎杖為蓼科蓼屬植物虎杖的干燥根莖和根?；⒄戎饕祯悺ⅫS酮類、芪類及酚類等的化合物，具有多種藥理活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒、降血脂、抗氧化、改善心血管等。其中黃酮類、二苯乙烯類及蒽醌類具有顯著的降脂作用，被認(rèn)為是虎杖中降脂作用有效組分[1]。

PCSK9是一個(gè)脂質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白。PCSK9是當(dāng)前最熱的降脂靶點(diǎn)之一，在高脂血癥、糖尿病及心血管疾病等中有著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)家族遺傳性高膽固醇血癥發(fā)生的重要原因之一是PCSK9突變基因[2]。同時(shí)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示了PCSK9在調(diào)節(jié)膽固醇水平上的作用，PCSK9與常染色體顯性家族性高膽固醇血癥有關(guān)的基因。

本文以降脂相關(guān)中藥虎杖為研究對(duì)象，利用PCSK9磁珠親和結(jié)合HPLC技術(shù)快速特異檢測(cè)抑制PCSK9成分，為尋找PCSK9直接作用成分的篩選提供方法參考，同時(shí)對(duì)虎杖藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究有一定推動(dòng)作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與試劑

虎杖（寧波中醫(yī)院門(mén)診部）；Tris-base（Sigma公司）；咪唑（美侖生物）

1.2 設(shè)備

高效液相色譜儀（美國(guó) 安捷倫）；超聲細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限股份有限公司）；凝膠成像（BIO-RAD）；電子天平（德國(guó)Sartouris）。

1.3 試劑配制

（1）Wash Buffer：20mmol/L Na3PO4，500mmol/L NaCl，0～40mmol/L Imidazole，pH 7.4。

（2）Elution Buffer：20mmol/L Na3PO4，500mmol/L NaCl、400mmol/L Imidazole，pH 7.4。

（3）100mmol/L PBS：稱取2.964g NaH2PO4·2H2O，85g NaCl，30g Na2HPO4·12H2O，雙蒸水H2O定容至1L，調(diào)pH為 7.4。其他離子強(qiáng)度的PBS溶液按比例稀釋即可。

（4）SBC-115076溶液：取適量SBC-115076，以DMSO配成100mmol/L溶液，即得。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 條件優(yōu)化

（1）孵育時(shí)間考察。PCSK9磁珠于離心管中（加入1mL，PBS重懸，重復(fù)操作一次。磁性分離，加入含1μL SBC-115076溶液，PBS溶液 1mL，將離心管放置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫分別旋轉(zhuǎn)孵育5min、10min、15min及20min，考察不同孵育時(shí)間下陽(yáng)性藥的吸附量。分離后棄上清液。加入PBS 500μL，反復(fù)顛倒離心管1min使磁珠重懸，磁性分離，保留磁珠，棄上清液。重復(fù)清洗一次。每個(gè)離心管中加入200μL Elution Buffer，充分混勻磁珠，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)洗脫10min。磁性分離，收集洗脫液，第二次洗脫，合并兩次的洗脫液。氮吹吹干，加入100μL甲醇超聲溶解，濾過(guò)，得樣品。

對(duì)照組是空載磁珠與SBC-115076結(jié)合。HPLC檢測(cè)SBC-115076的吸附量，通過(guò)對(duì)比確定最適孵育時(shí)間。

（2）分別在4 ℃、10 ℃、25 ℃及37 ℃孵育，考察不同溫度的影響。

2.2 液相色譜條件

Agilent 1260 HPLC 色譜系統(tǒng)，選擇SB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）。流動(dòng)相由0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）組成，梯度洗脫：0～15min，15%～90% B，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Mean±SD表示，采用Student-t檢驗(yàn)，p＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，p＜0.01表示顯著性差異。制圖由 Graphpad prism 7 軟件進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 孵育時(shí)間對(duì)PCSK9抑制劑SBC-115076與磁珠結(jié)合的影響

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合率逐步提升，并在15min達(dá)到最高蛋白載量（圖1）。而后，隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，蛋白載量呈降低趨勢(shì)。在長(zhǎng)時(shí)間的孵育過(guò)程中，蛋白有失活或非特異結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)，最終導(dǎo)致蛋白結(jié)合率下降。因此選擇合適的孵育時(shí)間對(duì)蛋白結(jié)合很重要，本實(shí)驗(yàn)選取15min為結(jié)合孵育時(shí)間。

圖1 孵育時(shí)間對(duì)SBC-115076與磁珠結(jié)合的影響

3.2 孵育溫度對(duì)PCSK9抑制劑SBC-115076與磁珠結(jié)合的影響

隨著溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，有利于分子間的碰撞和相互作用。如圖2所示，隨著溫度的升高，PCSK9抑制劑SBC-115076與磁珠的結(jié)合率逐步上升，在25 ℃下孵育時(shí)達(dá)到最大。而后隨著溫度的提升，結(jié)合率下降。高溫在增加分子熱運(yùn)動(dòng)的同時(shí)，亦會(huì)促使蛋白構(gòu)象變化，致使活性喪失。而且過(guò)劇的分子熱運(yùn)動(dòng)，亦會(huì)使已結(jié)合的PCSK9磁珠再次斷裂。因此選擇合適的孵育溫度對(duì)蛋白結(jié)合很重要，本實(shí)驗(yàn)選取25℃為孵育溫度。

圖2 孵育溫度對(duì)SBC-115076與磁珠結(jié)合的影響

3.3 樣品提取液的優(yōu)化

提取溶液有甲醇-水系統(tǒng)、乙醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，比較甲醇、乙醇和乙腈（90%、70%、50%）的提取效果。將虎杖與磁珠孵育考察加標(biāo)樣回收率，當(dāng)提取稀釋液中乙腈含量達(dá)到70%時(shí)，加標(biāo)回收率下降到48.09%。為保證抗體不被破壞，選取70%乙醇作為提取液（圖3）。

圖3 提取液對(duì)虎杖樣品加標(biāo)的影響

3.4 辨識(shí)虎杖中抑制PCSK9成分

由圖4可知，在280nm波長(zhǎng)下，圖4（a）圖與圖4（b）比較，保留時(shí)間14.4min峰面積明顯較高，排除親和過(guò)程中引入的雜質(zhì)影響，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定峰為虎杖苷，是潛在PCSK9抑制劑。

圖4 PCSK9磁珠垂釣虎杖中親和成分HPLC對(duì)比圖譜

3.5 含量測(cè)定

3.5.1 分析條件的確定

通過(guò)HPLC對(duì)待分析樣品進(jìn)行基本分離，綜合考慮分離時(shí)間及分離效果，最終選擇水/乙腈流動(dòng)相系統(tǒng)，因所需篩選藥材較多，本部分未對(duì)其具體流動(dòng)相比例進(jìn)行逐一優(yōu)化，選取統(tǒng)一的梯度洗脫系統(tǒng)，分別在203nm、254nm、280nm、320nm 下進(jìn)行檢測(cè)，以綜合涵蓋虎杖中各類成分。因203nm下檢測(cè)雜質(zhì)干擾較大，且本實(shí)驗(yàn)所選流動(dòng)相中含有0.1%甲酸，在末端吸收203nm下會(huì)導(dǎo)致基線漂移，影響后續(xù)分析，故此部分主要比對(duì)其他波長(zhǎng)下的峰差異，確定親和成分。

3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

在色譜條件下，對(duì)六個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)行測(cè)定，峰的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)信噪比（S/N）確定檢出限和定量限?；⒄溶赵诰€性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=378.4X-43.2，相關(guān)系數(shù)為0.999，檢出限為23.1μg/kg，定量限為231.5μg/kg。

3.5.3 準(zhǔn)確度和精密度

加入低、中、高三個(gè)濃度水平的虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化的磁珠方法進(jìn)行孵育，結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定虎杖苷含量，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算3個(gè)濃度水平下虎杖苷的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果在3個(gè)濃度水平下虎杖苷平均回收率為95.78%～102.51%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.4%～3.5%，小于5.0 %，說(shuō)明該方法可靠，精密度良好，符合高效液相色譜法快速測(cè)定的要求。

3.5.4 日間精密度考察

連續(xù)5d的加標(biāo)回收率在 101.63%～103.01%，日間精密度在 4.88%～5.72%，重現(xiàn)性良好（表1）。

表1 虎杖磁珠-高效液相色譜的加標(biāo)回收率和RSD

4 討論

磁珠親和法可將靶標(biāo)固定于磁珠上，進(jìn)而從混合物中有效地結(jié)合并分離相應(yīng)配體，具有簡(jiǎn)便快捷、特異性高的優(yōu)點(diǎn)。運(yùn)用此方法，已成功篩選出多種靶標(biāo)的中藥特異親和成分藥物在體內(nèi)可與其靶點(diǎn)結(jié)合，改變靶點(diǎn)的相應(yīng)生理功能，進(jìn)而達(dá)到治療效果。本研究基于免疫磁珠結(jié)合高效液相色譜法分析，建立了一種篩選PCSK9富集含量檢測(cè)方法。以PCSK9抑制劑SBC-115076為工具藥，對(duì)其與PCSK9磁珠的結(jié)合關(guān)鍵影響因素（孵育溫度和孵育時(shí)間）進(jìn)行了優(yōu)選。最終優(yōu)選PCSK9磁珠親和條件為：磁珠與藥物共孵育15min，孵育溫度25℃。PCSK9調(diào)節(jié)LDL-C水平受基因位點(diǎn)突變的影響，通過(guò)兩種方法突變，其一是增強(qiáng)PCSK9上調(diào)LDL-C的能力，導(dǎo)致高膽固醇血癥的功能獲得型突變，第二是降低或取消PCSK9上調(diào)LDLC的能力，導(dǎo)致低膽固醇血癥的功能缺失型突變[3-4]。諸多中藥，如銀杏葉、紅花、何首烏、懷牛膝、虎杖、澤瀉等均表現(xiàn)出較好的降脂作用，多年臨床，安全性佳。近年關(guān)于中藥與PCSK9的相互作用的研究發(fā)現(xiàn)中藥，單體成分包括虎杖苷[5]、姜黃素[6]、小檗堿[7]和丹參酮IIA[8]等或藥用部位都對(duì)PCSK9蛋白轉(zhuǎn)錄或表達(dá)水平有抑制作用。同時(shí)，中藥或其單體成分在整體水平上亦展現(xiàn)出對(duì)血漿中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及PCSK9水平異常的改善作用。中藥成分復(fù)雜，虎杖藥理活性廣泛。本研究選擇虎杖這一具有降脂活性的常用中藥進(jìn)行PCSK9磁珠親和選擇，結(jié)合HPLC含量測(cè)定，快速檢測(cè)出虎杖中抑制PCSK9成分虎杖苷，進(jìn)一步明確了虎杖苷與PCSK9的親和作用，為天然產(chǎn)物虎杖苷的創(chuàng)新開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。