小檗堿介導(dǎo)的抗腦缺血凋亡通路研究進(jìn)展

田 悅，王 奇，羅玉敏

0 引言

腦缺血具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的特點(diǎn)，同時也給社會帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，對人類健康造成了很大影響。在各種腦卒中疾病中，缺血性腦卒中所占比例超過80%[1-2]。其原因多是由于動脈管腔狹窄和血栓形成，以及血管痙攣等原因，進(jìn)而引起大腦的缺血缺氧反應(yīng)，患者多會出現(xiàn)偏癱、偏身感覺障礙、偏盲、意識障礙等臨床表現(xiàn)。當(dāng)前，臨床上多采用靜脈溶栓療法治療腦缺血。重組組織纖溶酶原激活劑(Recombinant tissue-type plasminogen activator,r-tPA)具有可觀的溶栓作用，是目前被批準(zhǔn)使用的一類用于治療急性腦缺血的藥物，但該藥必須在發(fā)病后3～4.5 h的治療時間窗內(nèi)應(yīng)用方可達(dá)到理想療效，臨床上僅有少數(shù)患者能夠接受該治療。相比之下，對腦缺血患者進(jìn)行相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)治療顯得至關(guān)重要[3-5]。腦缺血后的病理損傷，一般與細(xì)胞內(nèi)鈣離子失衡、興奮性中毒、自由基介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡、血腦屏障破壞等有關(guān)，近年來在神經(jīng)保護(hù)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，研究方向大多與鈣通道阻滯劑、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑、自由基清除劑、抗炎藥、抗凋亡劑、抗氧化劑等相關(guān)[6]。有文獻(xiàn)報道，在腦缺血后進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)治療，可減少神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，延長治療時間窗[7]。傳統(tǒng)的神經(jīng)保護(hù)治療一般采用單一機(jī)制干涉，無法從多方面干預(yù)腦缺血患者的病理生理級聯(lián)反應(yīng)[8]。而且由于人與實(shí)驗(yàn)動物大腦結(jié)構(gòu)功能的差異性、臨床治療時間窗的限制、臨床治療期間血藥濃度的差異性、臨床實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)的差異性及臨床實(shí)驗(yàn)的設(shè)計缺陷等因素，神經(jīng)保護(hù)藥物在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究階段有一定療效，但在臨床實(shí)驗(yàn)中則鮮有成功[6]。因此，目前尚無有效的神經(jīng)保護(hù)藥物可應(yīng)用于臨床。隨著對腦缺血研究的深入，迫切需要新的治療藥物以延長治療時間窗，減少神經(jīng)元丟失，促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。近年有研究表明，利用小檗堿對腦缺血動物模型進(jìn)行干預(yù)，能夠顯著減少腦梗死體積，減輕腦水腫，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[9]。

小檗堿，又名黃連素，是從傳統(tǒng)中藥黃連中提取出的一種季胺型異喹啉生物堿。近年研究表明，小檗堿具有良好的抗腫瘤、降血脂、治療糖尿病、抗動脈粥樣硬化、抗腦缺血、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗凋亡等作用[10-15]。本綜述總結(jié)了近年來研究發(fā)現(xiàn)的小檗堿抗腦缺血凋亡相關(guān)通路及相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步研究小檗堿的抗腦缺血作用提供思路。

1 腦缺血后的細(xì)胞死亡方式

腦缺血會導(dǎo)致缺血核心區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，同時，缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元也受到相應(yīng)的損傷，隨著時間的推移亦會逐漸死亡[16]。隨著缺血后再灌注的恢復(fù)，將會為大腦帶來更加嚴(yán)重的損害，稱為缺血/再灌注損傷[17]。一系列的反應(yīng)，均會引起神經(jīng)功能的進(jìn)一步損傷[18-19]。因此，腦缺血后，神經(jīng)元細(xì)胞多是以死亡而告終。常見的細(xì)胞死亡方式有壞死、凋亡、壞死性凋亡、細(xì)胞焦亡、自噬性細(xì)胞死亡、鐵死亡等[20-21]。但在腦細(xì)胞的眾多死亡方式中，目前研究最多的是神經(jīng)元凋亡。

2 小檗堿對凋亡相關(guān)基因的影響

腦缺血發(fā)生后，會引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷，而神經(jīng)元細(xì)胞的損傷則進(jìn)一步加劇了神經(jīng)元凋亡，如何保護(hù)缺血區(qū)與缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞免受凋亡，促進(jìn)大腦神經(jīng)功能恢復(fù)，發(fā)揮腦保護(hù)作用，是治療腦缺血的關(guān)鍵點(diǎn)[22]。細(xì)胞凋亡是指在各種刺激下誘導(dǎo)的、受基因調(diào)控的程序性死亡，具有主動耗能的特點(diǎn)[23]。神經(jīng)元細(xì)胞凋亡涉及眾多凋亡相關(guān)基因，研究較多的為B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)與半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)。其中，Bcl-2是重要的抗凋亡相關(guān)基因，Bax為促凋亡基因[24-27]。Caspase-3為凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵因子[28-30]。本綜述以小檗堿影響抗凋亡基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，論述小檗堿的神經(jīng)保護(hù)作用。

3 小檗堿對腦缺血凋亡通路的影響

3.1 小檗堿通過Akt/GSK3β/ERK抗凋亡信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用 蛋白激酶B(Akt)是一種由生長因子調(diào)控的絲氨酸/蘇氨酸激酶，磷酸化的Akt具有抗凋亡作用[31-32]。絲氨酸/蘇氨酸糖原合成酶激酶-3(GSK3β)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，磷酸化GSK3β對神經(jīng)細(xì)胞具有各種調(diào)節(jié)功能[33]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員[34]，磷酸化ERK能夠發(fā)揮相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用[35]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，磷酸化Akt/GSK3β/ERK可以通過抑制Caspase-3的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用[36-37]。同時，磷酸化Akt/GSK3β/ERK，能夠減少神經(jīng)毒性，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)揮相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用[38-40]。

有研究采用熒光圖像分析碘化丙啶(PI)攝取來評估缺氧缺糖(OGD)處理的腦缺血大鼠細(xì)胞損傷，通過Western blot分析Akt、GSK3β、ERK和JNK在腦缺血大鼠腦內(nèi)的表達(dá)，借助熒光底物Ac-DEVD-AFC裂解法測定Caspase-3活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血后磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)及磷酸化ERK(p-ERK)表達(dá)顯著減少，Akt、GSK3β及ERK表達(dá)顯著增加，大鼠腦內(nèi)Caspase-3活性增高，細(xì)胞凋亡增多，而小檗堿則能夠逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。同時，小檗堿治療后，PI攝取減少，證明細(xì)胞凋亡減少，該研究表明，小檗堿可以通過抑制大鼠腦缺血后Caspase-3的活性表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且該作用涉及Akt/GSK3β/ERK信號通路[41]。

Zhang等[42]采用Longa評分法[43]對永久性大腦中動脈閉塞(pMCAO)腦缺血大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，用標(biāo)準(zhǔn)干/濕重法測定腦含水量，采用TTC染色法測定大鼠腦缺血后梗死體積，采用免疫組化法測定大鼠腦缺血后腦內(nèi)p-GSK3β、p-Akt的表達(dá)，采用Western blot法測定大鼠腦缺血后腦內(nèi)Akt、p-Akt、GSK3β及p-GSK3β的表達(dá)。結(jié)果顯示，小檗堿治療能夠顯著降低大鼠神經(jīng)功能缺損評分，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，顯著降低大鼠腦含水量與腦梗死體積，顯著上調(diào)p-GSK3β、p-Akt的表達(dá)，該研究表明小檗堿對缺血性神經(jīng)損傷的保護(hù)作用涉及Akt/GSK3β信號通路。

3.2 小檗堿通過PI3K/Akt抗凋亡信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用 磷酸肌醇3激酶(PI3K)是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性，磷酸化PI3K具有神經(jīng)保護(hù)作用[44]。

在蒙古沙鼠腦缺血研究中，Kim等[45]以跳臺回避任務(wù)實(shí)驗(yàn)評估短暫性全腦缺血沙鼠的短期記憶，采用免疫組化法測定沙鼠全腦缺血后Caspase-3的表達(dá)，利用Western blot分析測定沙鼠全腦缺血后PI3K、Akt、Bax、Bcl-2的表達(dá)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血導(dǎo)致沙鼠短期記憶功能顯著下降，使其海馬磷酸化PI3K(p-PI3K)及p-Akt表達(dá)顯著減少，PI3K以及Akt表達(dá)顯著增多，同時，蒙古沙鼠腦海馬區(qū)的Caspase-3與Bax表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著減少，而小檗堿治療可以顯著減輕缺血誘導(dǎo)的沙鼠短期記憶功能損害，逆轉(zhuǎn)凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2及Caspase-3的表達(dá)，增加PI3K與Akt的磷酸化表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。該研究表明,小檗堿通過激活PI3K/Akt信號通路抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮其抗缺血性損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

在大鼠腦缺血研究中，Hu等[46]采用PC12細(xì)胞與大鼠腦海馬的原代神經(jīng)元缺氧缺糖處理方式，用MTT法測定小檗堿對PC12細(xì)胞缺氧缺糖的保護(hù)作用，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡，借助Western blot檢測缺氧缺糖處理PC12細(xì)胞后p-Akt、總Akt和Caspase-3下游凋亡信號的時間依賴性變化，同時，測定雙側(cè)頸總動脈缺血再灌注模型大鼠腦內(nèi)p-Akt以及Caspase-3的表達(dá)，利用實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測PI3K 與PI3K調(diào)節(jié)亞單位p55γ的mRNA水平。結(jié)果顯示，小檗堿以劑量依賴的方式顯著提高了細(xì)胞活力與細(xì)胞存活率，顯著降低了細(xì)胞Caspase-3的積累，促進(jìn)Akt磷酸化，上調(diào)了PI3K調(diào)節(jié)亞單位p55γ的表達(dá)。同時，小檗堿的治療可顯著上調(diào)腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)p-Akt的表達(dá)，抑制Caspase-3的表達(dá)。在使用PI3K抑制劑Ly294002與Akt抑制劑Akti-1/2后，小檗堿的細(xì)胞保護(hù)作用則被抑制，該研究表明，小檗堿通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

3.3 小檗堿通過SIRT1抗凋亡信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用 沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶-1(SIRT1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的保護(hù)作用，有研究表明，腦缺血后，SIRT1受到抑制，使其抗凋亡作用減弱，而激活SIRT1后，則能夠發(fā)揮相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用[47-49]。

為探討小檗堿預(yù)處理對腦缺血大鼠的影響，王博等[50]采用Longa 評分法對腦缺血再灌注大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，采用Western blot檢測大鼠腦缺血再灌注后大腦內(nèi)Bcl-2、Bax以及Caspase-3的表達(dá)，研究結(jié)果顯示，接受小檗堿預(yù)處理的腦缺血再灌注大鼠，神經(jīng)功能缺損評分顯著下降，大鼠腦組織中 Bcl-2 的表達(dá)顯著增多，Bax與Caspase-3的表達(dá)顯著減少，表明小檗堿能夠抑制大鼠腦缺血再灌注損傷過程中的細(xì)胞凋亡。在聯(lián)合使用 SIRT1 抑制劑 EX527 后，發(fā)現(xiàn)小檗堿對凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax及Caspase-3的作用被抑制。該研究提示，小檗堿能夠抑制腦缺血再灌注過程中的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而該過程涉及SIRT1抗凋亡通路。

3.4 小檗堿通過HIF-1與p53抗凋亡信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用 缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，是氧穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子。Chen等[51]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)能夠在體外直接結(jié)合mdm2癌基因，但卻不能與p53抑癌基因在體外直接結(jié)合。不過，mdm2表達(dá)可以顯著增強(qiáng)p53和HIF-1α在體內(nèi)結(jié)合，表明mdm2可能在HIF-1α與p53之間起到橋梁作用，促進(jìn)二者在細(xì)胞中相互作用。同時，HIF-1可以增加p53的穩(wěn)定性，HIF-1能夠通過與p53泛素連接酶mdm2結(jié)合來調(diào)節(jié)Bax等凋亡相關(guān)蛋白，從而誘導(dǎo)程序性細(xì)胞凋亡。此外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，p53的表達(dá)具有促凋亡作用，而抑制其表達(dá)，則是發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵點(diǎn)[52]。

Zhang等[53]采用Western blot檢測大鼠大腦中動脈閉塞后腦組織內(nèi)HIF-1α及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)，采用TUNEL檢測法和免疫組織化學(xué)法檢測大鼠大腦中動脈閉塞后腦組織細(xì)胞凋亡程度與HIF-1α及p53的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血后大鼠腦內(nèi)HIF-1α和p53表達(dá)顯著增多，而小檗堿可以顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。同時，小檗堿預(yù)處理也顯著降低了大鼠腦缺血后腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡程度，顯著增加了Bcl-2的表達(dá)，減少了Bax與Caspase-3的表達(dá)。該研究表明小檗堿能夠通過下調(diào)HIF-1α和p53的表達(dá)，進(jìn)而抑制大鼠腦缺血后神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

4 小結(jié)

綜上所述，小檗堿主要通過Akt/GSK3β/ERK、PI3K/Akt、SIRT1、HIF-1/p53信號通路，影響凋亡相關(guān)基因，增加Bcl-2的表達(dá)[45,50,53]，減少Bax的表達(dá)[45,50,53]，抑制Caspase-3的表達(dá)[41,45-46,50,53]，從而發(fā)揮相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用。

目前，腦缺血仍是威脅人類生命安全的醫(yī)學(xué)難題，尋找對腦缺血患者更好的神經(jīng)保護(hù)治療方法，是眾多科學(xué)家努力的方向。小檗堿可能成為一種神經(jīng)保護(hù)候選藥，其改善血腦屏障通透性的特性，使其在腦缺血神經(jīng)保護(hù)方面具有巨大的潛力[42]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)小檗堿預(yù)處理的腦缺血模型，能夠顯示出預(yù)防腦缺血、保護(hù)神經(jīng)元免受缺血缺氧損害、改善神經(jīng)功能缺損的良好作用[54-55]。同時，小檗堿所具有的良好的抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡作用，使其在神經(jīng)保護(hù)方面具有更大的優(yōu)勢。此外，研究發(fā)現(xiàn)，正常劑量下小檗堿具有很小的毒性與副作用[56]。因此，將小檗堿作為抗腦缺血的理想藥物，可能會發(fā)揮良好的神經(jīng)保護(hù)作用。但目前對小檗堿的認(rèn)識還不夠全面，小檗堿還有更多的藥理作用亟待研究與開發(fā)，如何讓小檗堿以最佳的抗凋亡通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用并保證其安全性，還需要在今后的研究中進(jìn)一步探索。