川芎嗪對(duì)感染性休克大鼠腦組織PI3K/AKT信號(hào)通路及熱休克蛋白70的影響

陳世華，付緒華，袁丹桂，郭文濤

感染性休克是一種嚴(yán)重的疾病，常繼發(fā)于感染、嚴(yán)重外傷、燒傷和大手術(shù)等。嚴(yán)重感染性休克可能發(fā)展為多器官功能障礙綜合征，甚至死亡。感染性休克具有較高的死亡率[1]。目前，每年有超過100萬例感染性休克新病例，死亡率為20%～40%[2]。感染性休克的快速發(fā)展和高死亡率對(duì)臨床治療提出了巨大挑戰(zhàn)[3]。腦損傷是感染性休克的常見并發(fā)癥，因此，研究感染性休克引起的腦損傷發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(AKT)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典的信號(hào)通路之一，也是代謝和促分裂原信號(hào)(如能量、氨基酸、胰島素或生長因子)的關(guān)鍵換能器，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯和細(xì)胞代謝，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖[4]。PI3K/AKT信號(hào)通路在多種腦部疾病中有研究，如局灶性腦梗死[5]、缺血性腦損傷[6]等，但PI3K/AKT信號(hào)通路在感染性休克腦損傷中研究較少。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)根據(jù)表觀分子大小分為幾個(gè)家族，包括HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP32和小型HSP[7]。所有HSP中，HSP70是分子伴侶蛋白和折疊催化劑細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的核心組成部分，也是伴侶蛋白家族中高度應(yīng)激的誘導(dǎo)成員[8]。高度保守的分子伴侶HSP70具有有效的抗凋亡特性及細(xì)胞保護(hù)作用[9]。

川芎嗪是從中草藥川芎中提取的一種生物活性成分[10]。川芎嗪是常用的中成藥之一，在我國已廣泛用于心血管疾病的輔助治療[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪在多種分子靶標(biāo)上具有調(diào)節(jié)能力，如抗炎、抗氧化劑、抗血小板和抗凋亡[12]。然而，關(guān)于川芎嗪在感染性休克腦損傷中的研究較少。本研究采用尾靜脈注射川芎嗪復(fù)制感染性休克大鼠模型，探討川芎嗪是否通過PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)感染性休克腦損傷有改善作用，是否與氧化應(yīng)激水平、炎性因子表達(dá)和HSP70蛋白表達(dá)有關(guān)，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，以期為臨床治療感染性休克腦損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只雄性SD大鼠，體重(180±20)g，購自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2019-0001]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì)嚴(yán)格經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，適應(yīng)環(huán)境1周，期間正常飲水飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 川芎嗪(HPLC≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；S-100β試劑盒均購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、一氧化氮(NO)試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)試劑盒和白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；蘇木精-伊紅(HE)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)染色試劑盒購自德國Roche公司；PI3K抗體、抗-AKT抗體、AKT抗體、GAPDH抗體和IgG抗體購自美國Abcam公司；HSP70抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 制備感染性休克大鼠模型 參照文獻(xiàn)[13]制備感染性休克大鼠模型，SD大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，右側(cè)頸動(dòng)脈置管監(jiān)測生命體征。尾靜脈緩慢注射5 mg/kg川芎嗪，構(gòu)建感染性休克模型。血壓降低為正常值的2/3，維持2～3 h以上，且伴有皮膚發(fā)紺、少尿等現(xiàn)象，提示感染性休克動(dòng)物模型制備成功。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 將60只SD大鼠分為假手術(shù)組(sham組)、感染性休克組(LPS組)、川芎嗪低劑量組(LPS+Lig-L組)和川芎嗪高劑量組(LPS+Lig-H組)，每組15只。sham組大鼠同時(shí)間尾靜脈注射相同體積的無菌生理鹽水。sham組、LPS組：腹腔注射無菌生理鹽水4 mL/kg；LPS+Lig-L組：60 mg/kg的川芎嗪，給藥體積為4 mL/kg；LPS+Lig-H組：120 mg/kg的川芎嗪，給藥體積為4 mL/kg。造模成功后腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水或川芎嗪溶液，24 h后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并迅速摘除腦組織。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血清S-100β和血清NSE含量測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，于腹主動(dòng)脈采血，并置于離心管中，以3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，按照酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測定各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線將樣品OD值代入，計(jì)算血清S-100β和NSE含量。

1.5.2 腦組織NO含量測定 將各組大鼠腦組織置于9倍體積磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，采用勻漿器充分研磨腦組織，均勻分散到勻漿中，凍融3次，并于4 ℃條件下，以3 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用硝酸還原酶法檢測組織NO含量。

1.5.3 腦組織SOD、MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6含量測定 將各組大鼠腦組織置于9倍體積PBS中，采用勻漿器分散到勻漿中，凍融3次，并在4℃條件下，以3 000 r/min離心15 min，收集上清液。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測定各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線將樣品OD值代入，計(jì)算腦組織SOD、MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)。

1.6 HE染色 各組大鼠腦組織，經(jīng)固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，并制成4 μm的石蠟切片。切片置于蘇木精染液中5 min，自來水清洗后，置于1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，并以流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色3 min，流水稍洗。之后切片置于梯度乙醇(70%、80%、90%、100%)中脫水，各5 min，再放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明，時(shí)間為5 min。將切片取出，以濾紙輕輕拭干切片上殘余的二甲苯，在組織上滴加中性樹膠封片，使用萊卡顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.7 TUNEL 各組大鼠腦組織經(jīng)脫水、包埋、切片并于0.9%氯化鈉注射液中孵育5 min。之后將切片以TdT反應(yīng)混合物37 ℃孵育60 min。再用PBS洗滌后，將組織用0.3%H2O2封閉，加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合物，在黑暗中于濕潤環(huán)境及37 ℃條件下孵育60 min。PBS洗滌切片3次。熒光顯微鏡下觀察TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量并拍照。

1.8 免疫印跡法(Western Blotting) 各組大鼠腦組織使用RIPA裂解提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將上清液與6×樣品緩沖液混合，95℃煮沸5 min，在10%SDS-PAGE上電泳，之后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜在室溫下使用脫脂牛奶封閉1 h，之后與PI3K抗體(1∶1 000)、AKT蛋白磷酸化(p-AKT)抗體(1∶1 000)、AKT抗體(1∶1 000)、HSP70抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶2 000)在4 ℃條件下過夜。將膜用PBS洗滌3次以除去第一抗體，并與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫下溫育1 h。使用PBS洗滌3次，并用ECL顯色試劑盒顯影曝光，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 川芎嗪對(duì)各組大鼠血清S-100β和NSE含量的影響 與sham組比較，LPS組大鼠血清S-100β和NSE含量增加(P<0.001)；與LPS組比較，LPS+Lig-L組和LPS+Lig-H組大鼠血清S-100β和NSE含量降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖1。

2.2 LPS對(duì)各組大鼠腦組織損傷的影響 HE染色結(jié)果表明，sham組大鼠腦組織海馬區(qū)表現(xiàn)正常形態(tài)，具有清晰的邊界和完整的細(xì)胞帶；LPS組大鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞排列散亂，無明顯邊界；LPS+Lig-L組和LPS+Lig-H組大鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞排列較整齊，邊界較LPS組清晰，具有完整的細(xì)胞帶。詳見圖2。

圖2 HE染色檢測各組大鼠腦組織損傷情況(×200)

2.3 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平比較 與sham組比較，LPS組大鼠腦組織SOD含量降低(P<0.001)，MDA和NO含量增加(P<0.001)；與LPS組比較，LPS+Lig-L組和LPS+Lig-H組大鼠腦組織SOD含量增加(P<0.05或P<0.01)，MDA和NO含量降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖3。

與sham組比較，＊P<0.001；與LPS組比較，#P<0.05，△P<0.01。圖3 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平變化(A為SOD；B為MDA；C為NO)

2.4 各組大鼠腦組織炎性因子表達(dá)水平比較 與sham組比較，LPS組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量增加(P<0.001)；與LPS組比較，LPS+Lig-L組和LPS+Lig-H組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖4。

與sham組比較，＊P<0.001；與LPS組比較，#P<0.05，△P<0.01。圖4 各組大鼠腦組織炎性因子表達(dá)水平比較(A為TNF-α；B為IL-1β；C為IL-6)

2.5 川芎嗪對(duì)各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果表明，與sham組比較，LPS組大鼠腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量增加(P<0.001)；與LPS組比較，LPS+Lig-L組和LPS+Lig-H組大鼠腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05或P<0.01)。詳見圖5。

與sham組比較，＊P<0.001；與LPS組比較，#P<0.05，△P<0.01。圖5 川芎嗪對(duì)各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響(×200)(A為熒光顯微鏡下圖像；B為各組陽性細(xì)胞數(shù)量比較)

2.6 各組大鼠腦組織PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 Western Blotting結(jié)果表明，與sham組比較，LPS組大鼠腦組織PI3K蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.001)，p-AKT表達(dá)降低(P<0.001)；與LPS組比較，LPS+Lig-L組和LPS+Lig-H組大鼠腦組織PI3K蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)，p-AKT表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)。詳見圖6。

2.7 各組大鼠腦組織HSP70蛋白表達(dá)比較 Western Blotting結(jié)果表明，與sham組比較，LPS組大鼠腦組織HSP70蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Lig-L組和LPS+Lig-H組大鼠腦組織HSP70蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。詳見圖7。

與sham組比較，＊P<0.001；與LPS組比較，#P<0.05，△P<0.01。圖6 各組大鼠腦組織PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較(A為Western Blotting檢測PI3K、p-AKT蛋白電泳圖；B為PI3K、p-AKT蛋白表達(dá))

與sham組比較，＊P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05，△P<0.01。圖7 各組大鼠腦組織HSP70蛋白表達(dá)比較(A為Western Blotting檢測HSP70蛋白電泳圖；B為HSP70蛋白表達(dá))

3 討 論

感染性休克也稱膿毒性休克，是由細(xì)菌毒素等引起的，以低血壓、低氧血癥、代謝性酸中毒、多器官功能障礙甚至死亡為特征的全身反應(yīng)性綜合征，病死率高達(dá)50%[14]。其中細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)失調(diào)在感染性休克的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[15]。感染性休克常見的動(dòng)物模型包括盲腸結(jié)扎和穿刺、結(jié)腸提升支架腹膜炎及靜脈內(nèi)注射細(xì)菌或內(nèi)毒素[16]。本研究通過腹腔注射川芎嗪構(gòu)建大鼠感染性休克模型，是常用的穩(wěn)定動(dòng)物模型。有研究表明，95%以上感染性休克是由細(xì)菌引起的，其中50%是革蘭陰性細(xì)菌。川芎嗪是革蘭陰性細(xì)菌的外膜成分，廣泛存在于具有強(qiáng)毒力的細(xì)胞中[17]。

川芎嗪是從中草藥川芎中提取的重要活性成分之一。有研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪通過抗缺血(如擴(kuò)張腦血管以增加腦血流量)、神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用緩解慢性腦灌注不足[18]。川芎嗪及其衍生物通過調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激和NO系統(tǒng)對(duì)腦中風(fēng)后再灌注和腦出血具有保護(hù)作用[19]。因此，本研究進(jìn)一步探討川芎嗪對(duì)感染性休克大鼠腦損傷的影響。

S-100β和NSE是腦損傷的標(biāo)志物，腦組織損傷時(shí)，S-100β和NSE表達(dá)顯著升高[20-21]。有研究表明，SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，可消除體內(nèi)新陳代謝過程產(chǎn)生的有害物質(zhì)，如氧自由基，從而修復(fù)損傷組織，MDA是自由基活化的標(biāo)志[22]。NO是一種自由基，其作為介質(zhì)、信使或細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子參與機(jī)體病理過程，內(nèi)毒素刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞，iNOS活性升高，NO含量增加[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)尾靜脈注射川芎嗪后，血清S-100β和NSE含量增加，腦組織SOD含量下降，MDA和NO含量增加，炎性因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)含量增加，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。給予川芎嗪治療后，大鼠血清S-100β和NSE含量減少，腦組織SOD含量增加，MDA和NO含量減少，炎性因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)含量減少，提示川芎嗪通過減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，緩解感染性休克大鼠腦損傷。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)通路，參與腦損傷環(huán)節(jié)。細(xì)胞凋亡在膿毒癥相關(guān)神經(jīng)元死亡中至關(guān)重要，其中PI3K/AKT發(fā)揮著重要作用[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)大鼠腦缺血再灌注具有明顯的保護(hù)作用，其可能與激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，從而抑制炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)尾靜脈注射川芎嗪后，腦組織細(xì)胞凋亡增加，PI3K蛋白表達(dá)水平下調(diào)，p-AKT表達(dá)降低；給予川芎嗪治療后，大鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，PI3K蛋白表達(dá)水平上調(diào)，p-AKT表達(dá)增加，提示川芎嗪可能激活PI3K/AKT信號(hào)通路從而抑制凋亡。

HSP是一種應(yīng)激蛋白，是由機(jī)體遭受應(yīng)激刺激后產(chǎn)生的，其中HSP70是主要的一種。HSP70在正常大鼠腦組織一般不表達(dá)，腦組織受到各種損傷被迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生。HSP70參與細(xì)胞內(nèi)蛋白折疊、裝配、降解、轉(zhuǎn)移和修復(fù)等過程，具有維持細(xì)胞穩(wěn)定、保護(hù)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定的作用[26]。喬小霞等[27]研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮可提高大鼠7 d存活率，具有抗感染性休克作用，可能與增加腦組織HSP70表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，川芎嗪可增加大鼠腦組織HSP70蛋白表達(dá)，對(duì)感染性休克具有一定的治療作用，與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致。

綜上所述，川芎嗪對(duì)感染性休克具有明顯的治療作用，可能與激活PI3K/AKT信號(hào)通路從而抑制氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡，提高HSP70蛋白表達(dá)有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，從而為臨床治療感染性休克腦損傷提供新方法。