基于SOCS1/STAT3信號通路探討miR-155對川崎病幼鼠心肌損傷的影響

李海洲，張 琳，王 瑾，郭玉梅，張金盈

川崎病多發(fā)生于5歲以下兒童，是一種以全身血管炎癥為主要病理特征的急性發(fā)熱性、出疹性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱、皮膚出疹、黏膜充血、淋巴結(jié)腫大、手足水腫等[1]。川崎病除引起冠狀動脈病變外，也可引起心肌損傷，50%～70%的川崎病患兒存在心肌炎或心肌損傷，導(dǎo)致部分川崎病患兒心臟收縮和舒張功能異常，嚴(yán)重危害生命健康，是后天性心臟病的主要病因[2]。川崎病發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床研究顯示，川崎病的發(fā)生與感染引起自身免疫功能異常有關(guān)[3]。微小RNA(miRNA)是一種非編碼的小分子RNA，參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)過程，miRNA表達(dá)異常與多種心血管疾病有關(guān)，川崎病患兒存在血清多種miRNA異常表達(dá)，通過調(diào)控下游靶基因，參與川崎病發(fā)生、發(fā)展過程，探討川崎病發(fā)病過程中異常表達(dá)的miRNA可能為治療川崎病提供新思路和新方法[4-5]。miR-155是一種多功能miRNA，在多種腫瘤組織異常表達(dá)，且與機(jī)體免疫關(guān)系密切，參與炎癥介導(dǎo)、T細(xì)胞分化等過程，與多種自身免疫性疾病有關(guān)[6]。miR-155在川崎病心肌損傷中的作用機(jī)制尚不明確，本研究通過建立川崎病幼鼠模型，探討miR-155對川崎病心肌損傷的影響及可能機(jī)制，尋求川崎病治療的分子標(biāo)志物，旨在為臨床治療川崎病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物、菌種 無特定病原體(SPF)級BALB/C雄性小鼠40只，4周齡，體質(zhì)量(15.30±1.50)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0001。小鼠飼養(yǎng)于清潔通風(fēng)環(huán)境，溫度(23±2)℃，濕度(50±5)%，明暗周期12 h/12 h循環(huán)標(biāo)準(zhǔn)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。干酪乳桿菌干菌種購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 含有miR-155抑制序列(miR-155-inhibitor)和無義隨機(jī)序列(miR-155-inhibitor-NC)的pcDNA3.1質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司)，小鼠CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(德國Miltenyi公司)，小鼠心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB)ELISA試劑盒(上海谷研實(shí)業(yè)有限公司)，兔抗小鼠細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(suppressor of cytokine signaling，SOCS1)單抗、兔抗小鼠信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and activators of transcription 3，STAT3)多抗、兔抗小鼠STAT3磷酸化(p-STAT3)多抗(美國Abcam公司)，羊抗兔二抗-HRP(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，UT6100酶標(biāo)儀(孚光精儀有限公司)，DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立川崎病幼鼠模型 采用干酪乳桿菌胞壁成分(lacto bacillus casei cell wall extract，LCWE)誘導(dǎo)川崎病模型：將干酪乳桿菌菌種接種于肉湯培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，常溫下以5 000 r/min(離心半徑10 cm)離心30 min，留取沉淀物，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，加入150 mL的SDS裂解液(40 g/L)過夜，沉淀物采用磷酸緩沖鹽溶液洗滌10次，加入250 μg/mL的RNA酶、DNA酶、胰蛋白酶，分別于培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫孵育4 h，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，常溫下以5 000 r/min(離心半徑10 cm)離心5 min，棄上清液。1 g沉淀物加入5 mL 磷酸緩沖鹽溶液，水浴超聲裂解2 h，以15 000 r/min(離心半徑12 cm)離心60 min，取上清液，即為LCWE。根據(jù)苯酚/硫酸比色法，測定上清液鼠李糖濃度，計(jì)算LCWE含量，采用磷酸緩沖鹽溶液將LCWE濃度調(diào)整為1 mg/mL。

1.2.2 動物分組 取30只小鼠，按每只小鼠0.5 mL腹腔注射LCWE，剩余10只為正常對照組，按每只小鼠0.5 mL腹腔注射磷酸緩沖鹽溶液，均注射1次。14 d后，將30只建模小鼠隨機(jī)分為陰性對照組和模型組、抑制組。按照LipofectamineTM2000說明書制備質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物，分別將含有miR-155-inhibitor、miR-155-inhibitor-NC的質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物，抑制組、陰性對照組按每只小鼠200 μL經(jīng)尾靜脈注射入體內(nèi)；正常對照組和模型組按每只小鼠200 μL注射磷酸緩沖鹽溶液。干預(yù)第1天、第7天分別注射1次。

1.2.3 標(biāo)本采集 干預(yù)7 d后，處死小鼠，腹主動脈采血，取2 mL加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝；另取2 mL血液3 000 r/min(離心半徑10 cm)離心5 min，取上清液保存于-70 ℃冰箱；摘取脾臟，放入冷Hanks液中；取心尖組織，一部分心肌組織置入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，一部分心肌組織保存于液氮中。

1.2.4 檢測心肌組織miR-155表達(dá) 取液氮保存心肌組織70 mg，提取總RNA并檢測RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)，反應(yīng)體系：2 μL模板cDNA，2×qPCR Mix 10 μL，1 μL正向、反向引物，加雙蒸水至總體積25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參基因，引物由上海生工合成，引物序列見表1。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

表1 miR-155引物序列

1.2.5 檢測血清cTnI、CK-MB、TNF-α、IL-6水平 取保存血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟，測定血清cTnI、CK-MB、TNF-α、IL-6水平，添加終止液結(jié)束反應(yīng)后，在450 nm處采用酶標(biāo)儀測定光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品cTnI、CK-MB、TNF-α、IL-6水平。

1.2.6 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織病理學(xué)變化 取多聚甲醛固定的心肌組織，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，切片機(jī)切片(厚度4 μm)，脫蠟，常規(guī)HE染色，乙醇脫水、二甲苯透明、封片，于顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)變化。

1.2.7 檢測脾臟Th17/Treg細(xì)胞分化 取脾臟，研磨過濾后獲得單細(xì)胞懸液，懸浮于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，采用磷酸緩沖鹽溶液+BSA+EDTA緩沖液沖洗兩次，根據(jù)CD4+T細(xì)胞分離試劑盒說明書采用磁珠分離法分離CD4+T細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞純度>95%，臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞存活率>93%。流式細(xì)胞儀檢測Th17(CD3+CD4+IL-17A+)細(xì)胞和Treg(CD4+CD25+FoxP3+)細(xì)胞比例。

1.2.8 檢測心肌組織SOCS1 mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)水平 取液氮保存的心肌組織80 mg，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SOCS1、STAT3 mRNA表達(dá)水平，方法同1.2.4。引物序列見表2。

表2 SOCS1 mRNA、STAT3 mRNA引物序列

1.2.9 檢測心肌組織SOCS1、STAT3、p-STAT3蛋白水平 取液氮保存的心肌組織80 mg，加入預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液中，4 ℃條件下，以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入RIPA裂解液，冰上充分研磨，裂解30 min；4 ℃條件下，以12 000 r/min離心30 min，棄上清液，采用免疫印跡法(Western Blotting)進(jìn)行蛋白定量測定，配制凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，分別將蛋白條帶放入SOCS1(1∶2000)、STAT3(1∶2000)、p-STAT3(1∶2 000)、β-actin(1∶5 000)一抗中，4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜，將蛋白條帶加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶4 000)，室溫孵育2 h，TBST溶液洗膜，加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影、定影，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量，目的蛋白相對表達(dá)水平以其與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌組織miR-155相對表達(dá)量比較 正常對照組、陰性對照組、模型組、抑制組miR-155相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=316.198，P<0.001)。與正常對照組比較，陰性對照組、模型組miR-155相對表達(dá)量升高(P<0.05)，抑制組miR-155相對表達(dá)量降低(P<0.05)；與陰性對照組、模型組比較，抑制組miR-155相對表達(dá)量降低(P<0.01)，陰性對照組和模型組miR-155相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組心肌組織miR-155相對表達(dá)量比較(±s)

2.2 各組血清cTnI、CK-MB水平比較 各組血清cTnI、CK-MB水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組比較，陰性對照組、模型組、抑制組血清cTnI、CK-MB水平升高(P<0.05)；與陰性對照組、模型組比較，抑制組血清cTnI、CK-MB水平降低(P<0.05)；陰性對照組和模型組血清cTnI、CK-MB水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組血清cTnI、CK-MB水平比較(±s)

2.3 各組血清TNF-α、IL-6水平比較 各組血清TNF-α、IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組比較，陰性對照組、模型組、抑制組血清TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與陰性對照組、模型組比較，抑制組血清TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)；陰性對照組和模型組血清TNF-α、IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表5。

表5 各組血清TNF-α、IL-6水平比較(±s) 單位：ng/L

2.4 心肌組織病理學(xué)變化 HE染色顯示，正常對照組心肌纖維排列整齊，走向規(guī)則，未見病理形態(tài)學(xué)改變；模型組和陰性對照組心肌纖維排列混亂，出現(xiàn)萎縮、斷裂，存在明顯炎性細(xì)胞浸潤；抑制組心肌纖維較模型組和陰性對照組明顯改善，心肌纖維排列較整齊，炎性細(xì)胞浸潤減少。詳見圖1。

圖1 心肌組織病理學(xué)HE染色圖像(×200)

2.5 各組脾臟Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例比較 各組脾臟Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組比較，陰性對照組、模型組、抑制組脾臟Th17細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例升高，Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例降低(P<0.05)；與陰性對照組、模型組比較，抑制組脾臟Th17細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例降低，Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例升高(P<0.05)；陰性對照組和模型組脾臟Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表6。

表6 各組脾臟Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例比較(±s) 單位：%

2.6 各組心肌組織SOCS1 mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)比較 各組心肌組織SOCS1 mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組比較，陰性對照組、模型組、抑制組心肌組織SOCS1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與陰性對照組、模型組比較，抑制組心肌組織SOCS1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；陰性對照組和模型組心肌組織SOCS1 mRNA表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組間STAT3 mRNA表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表7。

表7 各組心肌組織SOCS1 mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)比較(±s)

2.7 各組心肌組織SOCS1、STAT3、p-STAT3蛋白水平比較 各組心肌組織SOCS1、p-STAT3蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與正常對照組比較，陰性對照組、模型組、抑制組心肌組織SOCS1蛋白水平降低，p-STAT3蛋白水平升高(P<0.05)；與陰性對照組、模型組比較，抑制組心肌組織SOCS1蛋白水平升高，p-STAT3蛋白水平降低(P<0.05)；陰性對照組和模型組心肌組織SOCS1、p-STAT3蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組間STAT3蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表8、圖2。

表8 各組心肌組織SOCS1、STAT3、p-STAT3蛋白水平比較(±s)

圖2 Western Blotting檢測p-STATS、STAT3、SOCS1蛋白表達(dá)電泳圖

3 討 論

川崎病是兒童的常見疾病，5歲以下兒童發(fā)病率為80%～85%，可累及心血管系統(tǒng)，引起后天性心臟病。目前川崎病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，有研究顯示，遺傳因素、感染性因素、免疫因素等均影響川崎病的發(fā)生，其中，患兒體內(nèi)免疫失衡在川崎病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，包括體內(nèi)T細(xì)胞異常激活、細(xì)胞因子異常分泌及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常等[7-8]。由于川崎病常累及心臟，臨床治療川崎病具有一定局限性，因此，急需鑒定相關(guān)分子標(biāo)記物，探討川崎病的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

miRNA在天然免疫和獲得性免疫中具有重要的調(diào)控作用，在多種炎癥性疾病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎等疾病中異常表達(dá)[9-10]。miR-155與免疫細(xì)胞發(fā)育和分化過程關(guān)系密切，其表達(dá)異常影響炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，miR-155過表達(dá)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠miR-155水平顯著升高，與崔萍萍等[12]研究結(jié)果一致，表明miR-155在川崎病過程中表達(dá)異常升高。cTnI、CK-MB是川崎病心肌損傷的特異性指標(biāo)，具有較高的靈敏度和特異度，其水平異常與心肌損傷程度有關(guān)。TNF-α、IL-6參與川崎病心肌損傷的過程，TNF-α作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘發(fā)血栓形成，IL-6是一種促炎因子，發(fā)生川崎病時(shí)，血清TNF-α、IL-6水平升高，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，血栓形成，加快川崎病發(fā)生。Th17/Treg細(xì)胞失衡在川崎病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Treg細(xì)胞是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，可抑制機(jī)體病理性免疫反應(yīng)，維持機(jī)體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，Th17分泌的IL-17可誘導(dǎo)TNF-α、IL-6釋放，對炎癥及多種免疫性疾病具有促進(jìn)作用。有研究表明，小鼠發(fā)生心肌梗死后心臟miR-155表達(dá)增加，抑制miR-155基因表達(dá)后，可減輕心肌炎癥，同時(shí)心功能得到有效改善[13]。抑制病毒性心肌炎患兒高表達(dá)的miR-155，可改善Treg細(xì)胞失衡，促進(jìn)免疫應(yīng)答，減輕炎癥損傷，改善心臟功能[14]。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-155表達(dá)后，抑制組血清cTnI、CK-MB、TNF-α、IL-6水平下降，心肌損傷顯著改善，提示抑制miR-155表達(dá)對川崎病心肌損傷具有一定的改善作用，可能通過減少炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡，保護(hù)心肌組織免受損傷。

JAK/STAT信號通路廣泛參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程，并參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。STAT3參與Th17細(xì)胞關(guān)鍵基因表達(dá)，降低STAT3表達(dá)可抑制Th17細(xì)胞分化。SOCS家族是一種免疫分子，是JAK/STAT通路的負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白，可抑制p-STAT，從而抑制通路激活。SOCS1已證實(shí)是miR-155的靶基因，miR-155通過靶向抑制SOCS1，激活STAT3，促進(jìn)CD4+細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化[15]。本研究結(jié)果顯示，抑制組SOCS1 mRNA及蛋白表達(dá)水平下降，p-STAT3蛋白水平升高，提示miR-155可改善川崎病小鼠心肌損傷，可能通過調(diào)控SOCS1/STAT3通路，調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。有研究顯示，通過上調(diào)SOCS1表達(dá)，可下調(diào)Th17細(xì)胞相關(guān)因子，降低Th17/Treg比值，從而改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人Th17/Treg細(xì)胞失衡狀態(tài)[16]。通過抑制自身甲狀腺炎小鼠miR-155/SOCS1/STAT3通路，可減少Th17細(xì)胞分化，降低炎癥反應(yīng)，改善小鼠免疫失常[17]。川崎病發(fā)生過程中，miR-155表達(dá)水平顯著升高，從而靶向抑制SOCS1表達(dá)，提高p-STAT3水平，促進(jìn)Th17細(xì)胞大量分化，導(dǎo)致炎性因子聚集，加重炎癥反應(yīng)和心肌損傷，抑制miR-155表達(dá)后，可顯著改善川崎病引起的心肌損傷。

綜上所述，抑制miR-155可改善川崎病引起的心肌損傷，可能通過調(diào)控SOCS1/STAT3信號通路，調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，為臨床治療川崎病提供一定的參考。