山楂葉總黃酮對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌線粒體呼吸功能的影響

張 振，劉 嬋，王國(guó)龍，王 猛

通過(guò)藥物溶栓或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療急性心肌梗死使血流再通是臨床搶救病人的關(guān)鍵，心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion，MIR)損傷嚴(yán)重影響病人預(yù)后[1]。線粒體是心肌細(xì)胞重要的細(xì)胞器，通過(guò)呼吸鏈實(shí)現(xiàn)能量代謝釋放三磷酸腺苷(ATP)是基本功能，線粒體功能障礙是導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、加重MIR損傷的重要病理機(jī)制[2]。山楂葉總黃酮(hawthorn leaves flavonoids，HLF)是從山楂樹(shù)葉子中提取的黃酮類化合物，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡對(duì)心肌缺血再灌注大鼠發(fā)揮一定的保護(hù)作用[3-4]。本研究通過(guò)夾閉左冠狀動(dòng)脈前降支30 min方法制備MIR大鼠模型，探討HLF對(duì)MIR后心肌細(xì)胞線粒體功能的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠100只，7周齡，210～240 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(冀)2018-004]；實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境設(shè)置：室溫(25±1)℃、相對(duì)濕度(60±5)%、明暗12 h交替，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 HLF購(gòu)自山西晉城中晉藥業(yè)有限公司(總黃酮含量≥95%)；還原型輔酶Ⅱ(NADH)脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和ATP含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；膜電位(△ψm)、膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開(kāi)放度檢測(cè)試劑盒和Jc-1熒光探針均購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 DW-2000型動(dòng)物呼吸機(jī)(上海嘉鵬技術(shù)有限公司)，BL-A420型動(dòng)物心電圖機(jī)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，MTP-601F型熒光酶標(biāo)儀(日本 Corona公司)，TJ-6 Centrifuge型低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，UV-1200型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，H-7650型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組、給藥與模型制備 將100只大鼠進(jìn)行數(shù)字編碼，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、MIR組、HLF 25 mg/kg組、HLF 50 mg/kg組、HLF 100 mg/kg組[5]，各20只。各組大鼠于造模前10 min腹腔注射給藥，Sham組和MIR組腹腔注射生理鹽水。參照王平安等[6]方法制備MIR大鼠模型，實(shí)驗(yàn)過(guò)程實(shí)施二聯(lián)心電圖實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；造模結(jié)局判斷：夾閉左冠狀動(dòng)脈前降支后左心室心肌蒼白、發(fā)紺，心電圖示ST段弓背持續(xù)抬高或T波高聳，30 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾實(shí)現(xiàn)血流再灌注后ST段抬高或T波降低，判定為造模成功；假手術(shù)組不夾閉冠狀動(dòng)脈前降支，其余操作同MIR組。再灌注2 h后取材并進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.2 線粒體制備 參考文獻(xiàn)[7]，每組隨機(jī)取10只大鼠，經(jīng)頸椎脫臼處死后開(kāi)胸取心臟，于冰上剪取左心室心肌，稱重后加入9倍4 ℃冷裂解液(Tris 0.303 g，蔗糖42.79 g，EGTA 0.186 g，定容于500 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.4)，制備濃度10%的左心室心肌組織勻漿液，4 ℃條件下，以1 000 r/min離心10 min，取上清液；4 ℃條件下，以15 000 r/min離心15 min，取沉淀，即為線粒體。采用Lowry法檢測(cè)線粒體蛋白表達(dá)。

1.4.3 線粒體呼吸功能指標(biāo)和呼吸酶活性檢測(cè) 采用Clark氧電極法檢測(cè)態(tài)3呼吸(R3)、態(tài)4呼吸(R4)、呼吸控制率(RCR)，取1 mg蛋白量線粒體加入2.5 mL反應(yīng)介質(zhì)中30 ℃恒溫孵育1 min，加入20 μL顯色底物，2 min后加入10 μL二磷酸腺苷，連續(xù)耗氧曲線即為R3，二磷酸腺苷完全磷酸化后耗氧曲線為R4，R3、R4耗氧速率比值為RCR。按照試劑盒操作說(shuō)明，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)線粒體NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶活性。

1.4.4 線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和Ca2+濃度檢測(cè) 取1 mg蛋白量線粒體采用超聲波破碎，之后參照試劑盒操作說(shuō)明，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性；以CaCO3為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)原子化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)游離Ca2+濃度。

1.4.5 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 每組取剩余10只大鼠，頸椎脫臼處死后取左心室，切割成5 mm3組織塊，在4 ℃條件下，置入4%戊二醛溶液中固定24 h、4 ℃的1%鋨酸固定3 h后，梯度乙醇和無(wú)水丙酮脫水、氧化丙烯置換、Epon812環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋，70 nm厚度超薄切片后通過(guò)醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重電子染色，采用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.4.6 線粒體△ψm、MPTP開(kāi)放度檢測(cè) 取1 mg蛋白量線粒體，按照△ψm檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明處理后，采用JC-1熒光探針，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm)，熒光值越高提示△ψm表達(dá)越高。取1 mg蛋白量線粒體，按照MPTP開(kāi)放度檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明處理后，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)540 nm，發(fā)射波長(zhǎng)580 nm)，熒光值越高提示MPTP開(kāi)放度越高。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌線粒體呼吸功能指標(biāo)比較 與Sham組比較，MIR組線粒體呼吸功能指標(biāo)R3、RCR降低(P<0.01)，R4升高(P<0.01)；與MIR組比較，HLF 50 mg/kg組、HLF 100 mg/kg組R3、RCR升高(P<0.01)，R4降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌線粒體呼吸功能指標(biāo)變化(±s)

2.2 各組大鼠心肌線粒體呼吸酶活性和ATP含量比較 與Sham組比較，MIR組線粒體NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶活性和ATP含量降低(P<0.01)；與MIR組比較，HLF 50 mg/kg組、HLF 100 mg/kg組NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶活性和ATP含量升高(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌線粒體呼吸酶活性和ATP含量比較(±s)

2.3 各組大鼠心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和Ca2+濃度比較 與Sham組比較，MIR組線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性降低(P<0.01)，Ca2+濃度升高(P<0.01)；與MIR組比較，HLF 50 mg/kg組、HLF 100 mg/kg組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性升高，Ca2+濃度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和Ca2+濃度比較(±s)

2.4 各組大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)圖像 Sham組大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常；MIR組心肌線粒體排列紊亂、變性腫脹、數(shù)量減少、膜破裂、線粒體嵴結(jié)構(gòu)模糊、斷裂溶解等超微結(jié)構(gòu)病變；與MIR組比較，HLF各劑量組心肌線粒體超微機(jī)構(gòu)呈不同程度減輕，其中HLF 100 mg/kg組線粒體膜較完整、嵴結(jié)構(gòu)較清楚。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)圖像(×104)(A為Sham組；B為MIR組；C為HLF 25 mg/kg組；D為HLF 50 mg/kg組；E為HLF 100 mg/kg組)

2.5 各組大鼠心肌線粒體△ψm、MPTP開(kāi)放度比較 與Sham組比較，MIR組心肌線粒體△ψm降低(P<0.01)，MPTP開(kāi)放度升高(P<0.01)；與MIR組比較，HLF 50 mg/kg組、HLF 100 mg/kg組心肌線粒體△ψm升高(P<0.01)，MPTP開(kāi)放度降低(P<0.01)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠心肌線粒體△ψm、MPTP開(kāi)放度比較(±s，RFU)

3 討 論

心血管疾病發(fā)病率居我國(guó)居民疾病譜首位，其中急性心肌梗死具有起病急、進(jìn)展快、致死率高的特點(diǎn)，通過(guò)藥物或手術(shù)及時(shí)實(shí)現(xiàn)血管再通是挽救急性心肌梗死病人生命的關(guān)鍵，但MIR損傷嚴(yán)重影響病人預(yù)后。線粒體約占心肌細(xì)胞體積的1/3，是心肌細(xì)胞重要的細(xì)胞器，線粒體受損導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、自噬及壞死[8-9]，Prokudina等[10]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙在MIR損傷疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

近年來(lái)，隨著國(guó)家振興中醫(yī)藥戰(zhàn)略的實(shí)施，中醫(yī)藥治療心血管疾病逐漸得到關(guān)注與認(rèn)可。山楂葉為薔薇科植物山里紅或山楂的干燥葉，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥品種，味酸、性平，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂之功效，臨床用于氣滯血瘀、胸痹心痛、胸悶憋氣、心悸健忘等癥治療。HLF是山楂葉的主要活性物質(zhì)，包含槲皮素、蘆丁、牡荊素等成分，具有良好的抗氧化活性[11]。徐穎等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HLF對(duì)肥大心肌細(xì)胞線粒體具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，HLF治療后，能有效提高M(jìn)IR大鼠缺血區(qū)心肌線粒體R3、RCR并降低R4，改善NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶活性并提高ATP含量，提示HLF具有改善MIR大鼠心肌線粒體呼吸功能，提高能量代謝能力的作用。

線粒體功能障礙導(dǎo)致ATP合成受阻，進(jìn)而影響ATP依賴性酶活力。其中Na+-K+-ATP酶活力降低導(dǎo)致線粒體膜Na+/K+交換受阻，引發(fā)Na+/Ca2+交換，使Ca2+大量進(jìn)入線粒體，Ca2+-ATP酶活力降低，進(jìn)而引起線粒體Ca2+超載[13]。過(guò)量Ca2+對(duì)呼吸鏈氧化磷酸化過(guò)程具有抑制作用，加重線粒體呼吸功能障礙，形成惡性循環(huán)從而加重MIR損傷。線粒體△ψm是線粒體膜內(nèi)外電位差，具有重要的生理功能，Alizadeh等[14]研究顯示，△ψm降低導(dǎo)致ATP合成受阻。線粒體MPTP開(kāi)放度對(duì)維持線粒體離子平衡至關(guān)重要，線粒體受損導(dǎo)致MPTP開(kāi)放度升高而使△ψm下降、細(xì)胞色素C釋放等進(jìn)而加重線粒體損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，HLF治療后能改善MIR大鼠缺血區(qū)心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力，降低Ca2+含量，改善線粒體變性腫脹、數(shù)量減少、膜破裂、線粒體嵴結(jié)構(gòu)破壞等超微結(jié)構(gòu)病變，提高△ψm并降低MPTP開(kāi)放度，提示HLF對(duì)MIR大鼠缺血區(qū)心肌線粒體功能的保護(hù)作用可能與抑制線粒體Ca2+超載、保護(hù)線粒體△ψm和MPTP開(kāi)放度及抑制線粒體超微結(jié)構(gòu)病變有關(guān)。

綜上所述，HLF對(duì)MIR大鼠心肌線粒體呼吸功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制線粒體Ca2+超載、維持線粒體膜穩(wěn)定性有關(guān)。