抗乙肝病毒藥物對OH2溶瘤效果的影響

張思琪，谷相勇，劉濱磊*

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.武漢濱會生物科技股份有限公司)

肝癌作為一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國逐年上升[1]。有研究表明，乙型肝炎病毒作為誘發(fā)肝癌的最主要危險因素之一[2]，其所編碼的乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)在很多肝癌中存在高表達趨勢[3]。由于乙型肝炎相關(guān)的原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)通常同時攜帶乙肝病毒[4]，在臨床治療過程中，常采取在抗腫瘤治療的同時給予抗乙肝病毒來改善患者肝功能，降低肝臟病毒載荷量，延長肝癌患者生存期[5]。富馬酸替諾福韋二吡呋酯(TDF)[6]、阿德福韋酯(Ade)、替比夫定(Telb)[7]是目前3種經(jīng)常使用的核苷類抗乙肝病毒藥，臨床上廣泛運用于乙肝相關(guān)的原發(fā)性肝癌患者的治療。核苷類抗乙肝病毒藥主要是通過抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄，或是與HBV的DNA鏈競爭性結(jié)合，影響病毒復(fù)制，最終達到抗病毒的效果[8]。

Ⅱ型溶瘤單純皰疹病毒(oncolyticherps simplex virus Ⅱ，OH2)是在野生型單純皰疹病毒株Ⅱ型的基礎(chǔ)上通過基因編輯技術(shù)，在敲除神經(jīng)毒性基因(ICP34.5)、刪除免疫抑制基因(ICP47)的同時，在ICP34.5位點插入編碼的人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，hGM-CSF)基因序列，構(gòu)造出的一種溶瘤病毒[9]。因其溶瘤活性強，靶向性好，能攜帶多種外源基因，又同時兼具安全性強等特點[10],從而引起溶瘤病毒相關(guān)研究人員強烈關(guān)注。在目前的臨床試驗中，OH2注射液的治療效果及受試者對藥物的耐受性均表現(xiàn)良好，且患者注射部位反應(yīng)較小，安全性好[11]，具有很好的應(yīng)用前景。但在臨床對于乙型肝炎相關(guān)原發(fā)性肝癌的治療過程中，患者通常需要同時服用抗乙肝病毒藥物來延緩疾病的發(fā)展。本文旨在回答OH2作為一種改造后病毒，在對攜帶HBV肝癌患者的治療上，其療效是否會受到目前臨床常見的3種抗乙肝病毒藥物的影響，為OH2的肝癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和細胞

正常BALB/c小鼠，6～8周齡，無基因改造及免疫缺陷。購自湖北省疾控中心。

CT26-iRFP細胞(本實驗室提供)，是通過PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將近紅外熒光蛋白iRFP720轉(zhuǎn)入鼠結(jié)腸癌細胞CT26細胞株，并通過嘌呤霉素篩選獲得CT26-iRFP720單克隆細胞株[12]。

1.1.2 試劑與儀器

DME/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司。胎牛血清購自四季青公司。肌醇山梨醇緩沖液(IS Buffer)由本實驗室配制。胰酶購自Gibco公司。OH2病毒是通過HG52野生病毒株的基因組中剔除ICP34.5和ICP47基因,并插入hGM-CSF表達序列的改造病毒[13](本實驗室提供)重懸于IS Buffer并分裝凍存在-70℃冰箱中，在使用前進行快速解凍。每一個時間點的研究所用病毒都是新鮮解凍。實驗用病毒沒有重復(fù)凍融。Ade、TDF片均購自湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；Telb購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院。所有藥物使用時均獲得國藥準字號，且在保質(zhì)期內(nèi)。

二氧化碳培養(yǎng)箱購于日本松下公司。細胞計數(shù)儀購于賽默飛科技有限公司。動物活體成像系統(tǒng)購于PE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病毒準備

將按標準生產(chǎn)流程生產(chǎn)的1×108CCID50/mL的OH2病毒解凍后混合均勻，使用IS Buffer稀釋到約1×107CCID50/mL，分裝到EP管中凍存在-70℃冰箱中。

1.2.2 抗乙肝病毒藥物準備

依照藥物使用說明并根據(jù)人和鼠的體表面積比例計算小鼠每日給藥量，即若將人的單日有效劑量記為A，小鼠單日有效劑量記為B，按小鼠(20g)體表面積是人(70kg)的0.0026倍，則小鼠單日需使用的劑量為B=0.0026×A。Telb人使用劑量為600mg/d，故小鼠注射劑量為1.56mg/100μL。Ade人使用劑量為10mg/d，故小鼠每日劑量為26μg/100μL，TDF人使用劑量為300mg/d，故小鼠注射劑量為780μg/100μL。將Telb、TDF用無菌PBS充分溶解，Ade加入少量無水酒精充分溶解，然后用無菌PBS分別將3種藥物稀釋到目的濃度，最終用0.22μm的濾頭在生物安全柜中過濾除菌，分裝到EP管中，放4℃避光保存。

1.2.3 CT26-iRFP細胞準備

從液氮中取出一只CT26-iRFP細胞復(fù)蘇，使用含10%胎牛血清的DME/F12在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞匯合度達到80%～90%進行細胞傳代。待細胞達到80%～100%匯合度后收集培養(yǎng)瓶中的CT26-iRFP細胞，醫(yī)用離心機820g離心5min，隨后用無血清DME/F12重懸，并將細胞稀釋到1×107個/mL。

1.2.4 小鼠皮下移植瘤誘導(dǎo)

22只雌性BALB/c小鼠于右側(cè)腹部皮下注射100μL含有1×106CT26-iRFP鼠結(jié)腸癌細胞懸液以誘導(dǎo)腫瘤。成瘤后，分別量取腫瘤長徑(a)、短徑(b)，腫瘤體積(TV)的計算公式為：TV=1/2×a×b×b。

1.2.5 小鼠分組給藥及量瘤

待腫瘤體積達到約80mm3時，將22只荷瘤鼠隨機分為5組，每組4～5只，分別為陰性對照組(n=4)、OH2組(n=5)、OH2+Telb組(n=5)、OH2+Ade組(n=4)、OH2+TDF組(n=4)。第一次治療記為第0d，治療包括OH2病毒瘤內(nèi)注射和抗乙肝病毒藥物溶液腹腔注射。各治療組的病毒劑量和注射體積一致，為1×106CCID50/100μL/只，陰性對照組瘤內(nèi)注射病毒重懸用的肌醇山梨醇緩沖液(IS Buffer)100μL。同時，連續(xù)7d，各OH2+抗乙肝病毒藥物組動物每日經(jīng)腹腔注射100μL有效劑量的抗乙肝病毒藥物PBS溶液，陰性對照組和OH2單藥治療組動物于腹腔注射等量PBS。動物皮下植瘤后第10d(平均瘤體積約80mm3)開始用OH2治療，將第一次治療記為第0d，于第0、4、7d共給藥3次，實驗觀察時間為21d。在首次給藥后通過測量腫瘤體積來對病毒抑瘤效果進行評估。

1.2.6 小鼠腫瘤近紅外拍攝

在治療后第21d，將各組動物分組放入動物活體成像系統(tǒng)，拍攝腫瘤近紅外熒光表達圖片，并記錄同等面積下小鼠腫瘤的總熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 6.01軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠量瘤結(jié)果

研究結(jié)果表明在CT26-iRFP皮下移植瘤模型上，與陰性對照比所有瘤內(nèi)注射OH2的動物腫瘤生長趨勢更為平緩(圖1，封二)。給藥第21d，與陰性對照組比較，3組治療效果明顯(圖2，封二)：OH2組(P=0.0267)；OH2+Ade組(P=0.0071)；OH2+TDF組(P=0.0168)，且3組均有無瘤動物產(chǎn)生，但3個有效組之間療效無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。停藥一段時間后，3個有效組的腫瘤治療效果未見明顯反彈。OH2+Telb組與陰性對照組相比較抑瘤效果無顯著性差異(P=0.3105)。

2.2 小鼠腫瘤總熒光強度結(jié)果

在實驗第21d對各組小鼠分別進行近紅外熒光強度檢測。結(jié)果表明在CT26-iRFP皮下移植瘤模型上，小鼠腫瘤總熒光強度與量瘤數(shù)據(jù)的趨勢基本一致(圖3，封三)，已有兩只動物iRFP信號消失，且出現(xiàn)一只無瘤動物。其中OH2+Ade(P=0.0092)；OH2+TDF(P=0.0313)。OH2組雖與陰性對照組相比未見顯著性差異(P=0.0888)，但陰性對照組的腫瘤總熒光強度約為OH2組的兩倍(6.61×109±2.33×109vs 1.28×1010±1.96×109)，OH2+Telb組和陰性對照組相比在腫瘤總熒光強度方面未見顯著性差異，OH2+Telb組熒光強度為(1.07×1010±1.52×109)，陰性對照組為(1.28×1010±1.96×109)。見圖4(封三)。

3 討 論

溶瘤病毒作為一種目前新興的抗腫瘤生物治療技術(shù)受到了眾多研究者的關(guān)注和腫瘤患者的期待[14]。但對于同時攜帶HBV的腫瘤患者來說，他們?nèi)粘７玫目共《舅幬锸欠駮θ芰霾《镜闹委熜Чa(chǎn)生抑制作用，不單是研究者們需要考慮的問題，更是溶瘤病毒普適性的一種體現(xiàn)。

本文針對在腹腔分別注射Ade、TDF、Telb的情況下，溶瘤病毒OH2對CT26-iRFP腫瘤進行瘤內(nèi)給藥的治療效果進行實驗，評估OH2在3種常見抗HBV藥物的作用下的溶瘤情況。實驗結(jié)果表明，OH2+Ade組和OH2+TDF組的OH2對小鼠腫瘤有明顯的治療效果，且與OH2組的腫瘤大小無顯著性差異，甚至在腫瘤熒光強度上的數(shù)值更小。因此，我們認為OH2組對腫瘤依然有很好的治療作用，可能是由于樣本數(shù)量較少，另外兩只小鼠腫瘤熒光強度過高導(dǎo)致兩組間對比無差異。我們可以認為在本次試驗中Ade和TDF對OH2的溶瘤效果沒有影響。OH2+Telb組在第3次給藥結(jié)束后的一周時間里，腫瘤生長的速率低于陰性對照組，但相比OH2組其生長速率還是處于一個較快的趨勢。在隨后的一周時間內(nèi)，OH2+Telb組小鼠的腫瘤快速增長，其生長速率接近陰性對照組，但即使在這種情況下，在實驗結(jié)束時OH2+Telb組的腫瘤體積仍小于陰性對照組。我們認為，Telb對OH2的治療效果存在影響，且很有可能是通過中斷OH2在腫瘤中的持續(xù)性復(fù)制，或影響OH2中hGM-CSF的表達削弱了抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致在OH2治療后期，腫瘤的增長速率變快，最終未達到理想的抗腫瘤效果。

綜上所述，OH2+Ade組和OH2+TDF組對OH2的溶瘤效果影響小，更適合推薦給參與OH2抗腫瘤治療臨床試驗的HBV攜帶者使用，以減少抗乙肝病毒藥物對OH2治療效果的干擾。