秦巴山區(qū)蟲生真菌的分離鑒定與多樣性分析

王 軍,張 琨,張 緒,劉 柳,寧碩瀛,陳 川,萬 一

(1 陜西省微生物研究所 分子生物學(xué)研究中心, 陜西 西安 710043;2 陜西省科學(xué)院 秦嶺天然產(chǎn)物工程中心,陜西 西安 710043; 3 陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 漢中 723000;4 陜西省動(dòng)物研究所,陜西 西安 710032)

蟲生真菌(entomogenous fungi)是指寄生在昆蟲(或其他節(jié)肢動(dòng)物)幼蟲或成蟲上的真菌[1]。蟲生真菌對(duì)人類、環(huán)境和非靶標(biāo)生物的安全性較高，能夠大量生產(chǎn)，且易在害蟲間流行，因此在農(nóng)林害蟲種群控制及生物防治中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2-3]。能夠侵入昆蟲體內(nèi)寄生、導(dǎo)致昆蟲發(fā)病致死的真菌稱為昆蟲病原真菌。蟲生真菌是最大的昆蟲病原微生物類群，目前報(bào)道的有100多屬800種以上，寄主范圍廣泛[4-5]，是重要的害蟲生物防治資源。在生產(chǎn)上已得到廣泛應(yīng)用的主要有白僵菌、綠僵菌、蠟蚧輪枝菌等，報(bào)道的常見真菌殺蟲劑有8類約30種商品[6-7]。

隨著我國農(nóng)林業(yè)的不斷發(fā)展，優(yōu)勢(shì)品種的單一種植及高密度連作等耕作環(huán)境的改變導(dǎo)致蟲害逐年嚴(yán)重。一直以來對(duì)化學(xué)防治的依賴，造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和抗藥性問題日益嚴(yán)重。而生物防治具有高效、低毒、低殘留等特點(diǎn)，在昆蟲病害防治中發(fā)揮著越來越重要的作用，因此開展蟲生真菌種質(zhì)資源研究，調(diào)查不同生境下蟲生真菌的物種多樣性、群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)分布規(guī)律，對(duì)開發(fā)生物農(nóng)藥具有重要作用[8-9]。Tzean等[10]系統(tǒng)調(diào)查了臺(tái)灣地區(qū)蟲生真菌的物種多樣性，得到了24屬66種蟲生真菌，同時(shí)對(duì)分離的蟲生真菌種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。戴建青等[11]對(duì)山西省蟲生真菌的種類和資源進(jìn)行調(diào)查，共分離到蟲生真菌4目19屬67種，其中擬青霉屬和鐮孢霉屬等6屬為優(yōu)勢(shì)類群。劉玉軍等[12]對(duì)安徽紫蓬山蟲生真菌多樣性和分布特點(diǎn)研究表明，該區(qū)域蟲生真菌數(shù)量豐富，但物種多樣性指數(shù)較低，共得到436株蟲生真菌，鑒定為3科6屬13種。以上報(bào)道為我國在各地因地制宜開展蟲生真菌的研究、開發(fā)工作提供了有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集 2018-2019年連續(xù)2年，在5-9月從漢中市留壩縣、商洛市柞水縣、寶雞市鳳縣、西安市周至縣和鄠邑區(qū)5個(gè)不同地區(qū)(圖1)，選擇闊葉林、針葉林及低矮灌木等不同生境進(jìn)行昆蟲采集，分別在樹木的樹干、葉面以及地表等處采集罹病昆蟲尸體標(biāo)本。為了避免雜菌干擾，采集后的樣本分別單獨(dú)保存于4 ℃冰箱內(nèi)，并及時(shí)分離處理[14]。5個(gè)采樣地具體信息如下：留壩縣(106°58′15″E，33°22′42″N)，海拔585～2 610 m，年平均氣溫11.5 ℃；柞水縣(108°68′07″E， 33°38′13″N)，海拔1 000～2 800 m，年平均氣溫12.9 ℃；鳳縣(106°38′11″E， 34°08′21″N)，海拔1 010～2 738 m，年平均氣溫11.4 ℃；周至縣(108°20′15″E，33°57′02″N)，海拔388～3 015 m，年平均氣溫13.8 ℃；鄠邑區(qū)(107°19′03″E，33°45′32″N)，海拔399～3 762 m，年平均氣溫13.6 ℃。

圖1 秦巴山區(qū)昆蟲樣本采集區(qū)域Fig.1 Insect samples collection areas in Qinba Mountains

1.1.2 培養(yǎng)基及儀器 孟加拉紅培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基，均購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；引物ITS1和ITS4，均由上海捷瑞生物有限公司合成；真菌基因組試劑盒，購于北京天根生化科技有限公司；Chelex-100，購于Sigma公司；機(jī)械破壁儀，購于QIAGEN公司；離心機(jī)(XI)，購于基因有限公司；PCR擴(kuò)增儀(T100)，購于BIO-RAD公司。

1.2 蟲生真菌的分離純化

1.2.1 昆蟲樣品前處理 在無菌操作臺(tái)上，用消毒剪刀剪去昆蟲觸角、足、翅等器官。表面肉眼可見菌絲體的蟲體直接分離。表面無菌絲的蟲體，先用無菌水清洗昆蟲體表，再用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡30 s，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%次氯酸鈉浸泡2 min，最后用無菌水清洗。然后將蟲體置于2 mL離心管中，加1 mL 0.9% NaCl和2顆無菌鋼珠于破壁儀中勻漿2 min。勻漿液按照100～10-5進(jìn)行梯度稀釋，于4 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

1.2.2 蟲生真菌的分離純化 對(duì)表面肉眼可見菌絲體的蟲體，直接置于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。表面無菌絲的蟲體經(jīng)處理后，用移液槍分別吸取各梯度勻漿液0.1 mL，均勻涂布于孟加拉紅分離培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～14 d，待有菌絲長出時(shí)，及時(shí)用接種環(huán)挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到孟加拉紅培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，如此反復(fù)數(shù)次，直至得到純培養(yǎng)菌株，于4 ℃保藏待用[16]。

1.3 蟲生真菌的分類鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在無菌操作臺(tái)上，用接種環(huán)挑取適量菌絲在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線后，將高壓滅菌的蓋玻片45°傾斜插入培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落顏色、形態(tài)、質(zhì)地等特性，待蓋玻片上爬滿菌絲，取下蓋玻片制成切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察其孢子大小、形態(tài)特征、菌絲分枝情況等，并根據(jù)《昆蟲真菌學(xué)》[2]進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 (1)真菌DNA提取。采用改良真菌PCR反應(yīng)模板獲取方法[17]進(jìn)行以下操作：在無菌操作臺(tái)，取0.1 mL 10×Buffer TE(100 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,pH 8.0)于2 mL離心管中，用無菌接種環(huán)挑取菌體至離心管中，迅速振蕩混勻后加1顆無菌鋼珠，在機(jī)械破壁儀中40 Hz機(jī)械破壁1 min，隨后用無菌鑷子取出鋼珠，將其置于微波爐700 W高溫裂解3 min，待溫度降至室溫，離心獲取上清液作為DNA模板[18]。

(2)PCR擴(kuò)增。以提取的真菌DNA為模板，以真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGTTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′)對(duì)蟲生真菌的rDNA-ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Master Mix 15 μL，ITS1 0.5 μL，ITS4 0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 12 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

(3)ITS序列分析。將PCR產(chǎn)物送至北京奧科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序獲得的堿基序列在 NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲取相似度高的菌株信息，并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，最后確定菌株的分類地位[19]。

同志們，龍年伊始，萬象更新。讓我們抓住水利發(fā)展的大好時(shí)機(jī)，積極進(jìn)取，奮發(fā)有為，開拓創(chuàng)新，全力做好規(guī)劃計(jì)劃工作，為加快推進(jìn)水利改革發(fā)展作出新的更大的貢獻(xiàn)！

1.4 多樣性分析

對(duì)分離得到的蟲生真菌進(jìn)行種屬統(tǒng)計(jì)，采用Simpson多樣性指數(shù)(D)、Shannon-Wiener指數(shù)(H′)和均勻度指數(shù)(Pielou)(E)分析秦巴山區(qū)蟲生真菌的多樣性[20]。

E=H′/Hmax。

式中：S為物種數(shù)目；Pi為物種個(gè)體數(shù)占物種總個(gè)體數(shù)比例，Pi=Ni/N，Ni是樣本中第i物種的個(gè)體數(shù)，N是所有物種的個(gè)體數(shù)；H′為實(shí)測(cè)多樣性值；Hmax為最大多樣性值，Hmax=lnS。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦巴山區(qū)蟲生真菌的分離鑒定

由表1可見，2018-2019年從秦巴山區(qū)5個(gè)不同地區(qū)采集到昆蟲樣本243只，歸屬于8目。以單個(gè)蟲體為樣本，對(duì)采集的243只昆蟲分別進(jìn)行分離純化，共得到187株真菌。其中鱗翅目、鞘翅目、半翅目和同翅目昆蟲的出菌率均在90%以上，說明采樣地區(qū)的此類昆蟲易于被蟲生真菌感染。

表1 秦巴山區(qū)昆蟲采集數(shù)量及其出菌率Table 1 Quantity of insect collection and plating efficiency in Qinba Mountains

結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，對(duì)分離得到的187株真菌菌株進(jìn)行分類地位統(tǒng)計(jì)，結(jié)果(表2)表明，187株真菌歸屬于叢梗孢目、散囊菌目、毛霉目等9個(gè)目，暗色孢科、叢梗孢科、發(fā)菌科等13個(gè)科，棒束孢屬、綠僵菌屬、白僵菌屬、交鏈孢霉屬、枝孢屬、鐮刀菌屬、籃狀菌屬等22個(gè)屬。

表2 秦巴山區(qū)蟲生真菌類群組成及分離頻率Table 2 Composition and isolation frequency of entomogenous fungi in Qinba Mountains

表2(續(xù)) Continued table 2

2.2 秦巴山區(qū)蟲生真菌多樣性

從表2可以看出，187株真菌中，有120株真菌(64.17%)屬于叢梗孢目(Moniliales)，歸屬于2科9屬。其中棒束孢屬(Isaria)占比最大，有35株，約占18.72%;其次為枝孢屬(Cladosporium)，約占13.90%。經(jīng)計(jì)算，Simpson多樣性指數(shù)(D)為0.902，Shannon-Wiener指數(shù)(H′)為2.574，這說明秦巴山區(qū)蟲生真菌群落有一定的多樣性；而均勻度指數(shù)(Pielou)(E)為0.833，說明秦巴山區(qū)真菌群落物種均勻度偏低，優(yōu)勢(shì)種屬現(xiàn)象較為明顯。

5個(gè)昆蟲樣本采集地區(qū)的蟲生真菌種群多樣性如表3所示。由表3可知，Shannon-Wiener指數(shù)(H′)差異明顯，表明5個(gè)地區(qū)蟲生真菌群落均具有一定的多樣性，而均勻度指數(shù)(E)較高，說明5個(gè)地區(qū)物種分布的均勻程度較高。留壩縣、柞水縣、鳳縣和鄠邑區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌屬均為棒束孢屬(Isaria)，周至縣的優(yōu)勢(shì)菌屬為枝孢屬(Cladosporium)，但均不占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

表3 秦巴山區(qū)昆蟲蟲生真菌種群分布Table 3 Distribution of entomogenous fungi in Qinba Mountains

對(duì)不同地區(qū)采集的昆蟲數(shù)及分離到的蟲生真菌菌株數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果見圖2。由圖2可知，采自柞水縣、鄠邑區(qū)和周至縣的昆蟲出菌率較高(平均檢出率為106.17%)，留壩縣和鳳縣的出菌率稍低(平均檢出率為58.16%)，推測(cè)可能是留壩縣和鳳縣的年平均氣溫低于其他3個(gè)地區(qū)，不利于蟲生真菌的發(fā)生流行；也可能是留壩和鳳縣的采樣山區(qū)較其他3個(gè)山區(qū)離城市更遠(yuǎn)，自然生態(tài)環(huán)境更好，采集的昆蟲受人類活動(dòng)干擾比較小。

圖2 秦巴山區(qū)不同采樣區(qū)昆蟲數(shù)及蟲生真菌菌株數(shù)Fig.2 Number of insects and entomogenous fungi in different sampling areas in Qinba Mountains

3 討 論

蟲生真菌是農(nóng)林業(yè)害蟲種群調(diào)節(jié)的重要因子和生物防治的重要資源。利用蟲生真菌防治害蟲，已逐步成為一種以生物防治為主導(dǎo)的綜合治理重要途徑[21]。自20世紀(jì)50年代以來，我國學(xué)者先后對(duì)20多種蟲生真菌進(jìn)行研究，已登記注冊(cè)并商品化的蟲生真菌制劑有40余種[22]。

為探索秦巴山區(qū)農(nóng)林作物害蟲生防菌種資源，本研究于2018-2019年連續(xù)2年以秦嶺不同地區(qū)為采樣點(diǎn)，選擇闊葉林、針葉林及低矮灌木等不同生境進(jìn)行昆蟲采集及蟲生真菌的分離、鑒定，結(jié)果表明，從陜西境內(nèi)秦巴山區(qū)5個(gè)不同地區(qū)共采集昆蟲樣本243只，分離得到蟲生真菌187株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，分離得到的187株蟲生真菌歸屬于叢梗孢目、散囊菌目、毛霉目等9個(gè)目，暗色孢科、叢梗孢科、發(fā)菌科等13個(gè)科，交鏈孢霉屬、枝孢屬、擬青霉屬等22個(gè)屬。優(yōu)勢(shì)目為叢梗孢目(Moniliales)，除周至縣外其他4個(gè)地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌均為棒束孢屬(Isaria)。多樣性分析結(jié)果表明，秦巴山區(qū)蟲生真菌群落多樣性較為豐富，具有一定的多樣性；優(yōu)勢(shì)種屬現(xiàn)象較為明顯，群落物種均勻度偏低。5個(gè)不同昆蟲采集地區(qū)之間的蟲生真菌群落具有一定的多樣性，物種分布的均勻程度較高[23]。在采集的昆蟲種類中，以鱗翅目、鞘翅目、半翅目和同翅目昆蟲的出菌率較高，說明采樣地區(qū)的此類昆蟲易于被蟲生真菌感染，這為后續(xù)開發(fā)生物農(nóng)藥提供了一定的靶標(biāo)參考。本研究的5個(gè)采樣地區(qū)，僅能夠初步代表秦巴山區(qū)蟲生真菌資源的多樣性及分布規(guī)律，但還不夠全面，因此還需要收集更多地區(qū)的樣本進(jìn)行分析。

目前蟲生真菌的群落生態(tài)學(xué)和多樣性研究已逐步得到重視[24]。采用昆蟲真菌學(xué)和群落生態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，調(diào)查研究不同生境下蟲生真菌物種的多樣性、群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)分布規(guī)律，加強(qiáng)對(duì)蟲生真菌的生物學(xué)特性、與寄主相互關(guān)系和自然分布狀況的了解，為蟲生真菌資源的合理保護(hù)和持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)[25-26]。

4 結(jié) 論

秦巴山區(qū)蟲生真菌種類多、分布廣，多樣性較為豐富。該研究充實(shí)了陜西省境內(nèi)秦巴山區(qū)微生物資源信息，為該地區(qū)蟲生真菌資源的分布、多樣性研究及開發(fā)利用提供了有益參考，也為后續(xù)真菌代謝產(chǎn)物的活性探索以及農(nóng)林蟲害的生防研究奠定了基礎(chǔ)。