核桃內(nèi)種皮苦澀味品質(zhì)代謝組學(xué)分析

時羽杰，鄔曉勇，糜加軒，趙 倩，劉歡歡，萬雪琴

(1四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，四川 成都 611130；2成都大學(xué) a 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點實驗室，b 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都610106)

核桃(JuglansregiaL.)為胡桃科核桃屬落葉喬木，是世界四大干果(核桃、榛子、扁桃、腰果)之首[1]，核桃仁是核桃的主要食用和產(chǎn)品加工部位，其富含脂肪、蛋白質(zhì)、維生素E、礦物質(zhì)、甾醇等營養(yǎng)物質(zhì)[2]。核桃仁表面包裹著一層薄膜，即為核桃內(nèi)種皮。大量研究表明，核桃內(nèi)種皮是酚類物質(zhì)的重要來源，核桃90%以上的多酚和黃酮主要集中在核桃內(nèi)種皮中[3-4]。由于內(nèi)種皮富含多酚和黃酮類物質(zhì)會使得蛋白質(zhì)沉淀，而多酚類中的單寧、兒茶素等物質(zhì)會產(chǎn)生強烈的苦澀味，使得果實的口感受到影響[5-7]。Scharbert等[8]研究茶中51種可能影響口感的物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，茶湯的苦味主要來源于咖啡堿，澀味來源于黃酮醇-糖苷，還首次發(fā)現(xiàn)黃烷醇-3-糖苷既有澀味，又能增強咖啡堿苦味。Frydman等[9]發(fā)現(xiàn)，柚和酸橙中含有大量的柚皮苷，其含量占類黃酮物質(zhì)總量的75%以上，是造成苦味的主要糖苷類物質(zhì)。Zhang等[10]基于電子舌技術(shù)測定穿心蓮苦味，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯、14-脫氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯等6種物質(zhì)含量與苦味呈顯著正相關(guān)。李露雙等[11]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析麻竹筍中苦澀味物質(zhì)的形成發(fā)現(xiàn)，糖酵解途徑、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成途徑與苦澀味物質(zhì)合成密切相關(guān)。大多數(shù)此類研究集中在茶、中藥和水果的苦澀味物質(zhì)上，而有關(guān)干果類核桃內(nèi)種皮苦澀味物質(zhì)的組成及其合成調(diào)控機理的研究尚屬空白。

代謝組學(xué)(metabolomics)是繼基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)后興起的一門系統(tǒng)生物學(xué)科[12]。代謝組學(xué)技術(shù)通過高通量化學(xué)分析對生物體內(nèi)相對分子質(zhì)量小于1 000的代謝物進行定性和定量分析[13]，從中檢測并篩選出具有顯著差異的代謝物質(zhì)，并以此為基礎(chǔ)研究生物體的代謝過程和變化機制[14]。常被用于疾病診斷和藥物鑒定[15-17]、植物代謝和抗逆響應(yīng)機制研究[18-19]、家系圖譜分析[20]、食品營養(yǎng)成分和品質(zhì)研究[21-22]等方面。Narduzzi等[23]采用UHPLC-ESI-QTOF-MS技術(shù)對不同品種的葡萄進行代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，澀味較重的歐亞種葡萄果皮中原花青素含量比雜交品種更高。Francini等[24]對不同品種的蘋果干進行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，兒茶素、表兒茶素和綠原酸等酚類物質(zhì)是區(qū)別不同品種的關(guān)鍵物質(zhì)，且與其苦澀味密切相關(guān)。Gao等[25]利用UPLC-MRM-MS技術(shù)分析4種具代表性筍種的苦味后發(fā)現(xiàn)，其主要來源于L-苯丙氨酸、尿苷、L-鳥氨酸等，其中L-苯丙氨酸貢獻最大。但運用代謝組學(xué)技術(shù)分析不同苦澀味核桃內(nèi)種皮代謝物組分及其差異的研究也尚未見報道。

本研究以無苦澀味和重苦澀味的核桃內(nèi)種皮為材料，利用超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)和代謝組學(xué)方法，檢測2種材料中的代謝組分，篩選其中差異顯著的代謝物質(zhì)，分析其相關(guān)的代謝通路，揭示苦澀味形成的分子機制，以期為核桃內(nèi)種皮的代謝物質(zhì)組成和核桃果實品質(zhì)的改善研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

核桃無性系是由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)核桃課題組于2009-2010年在四川馬邊、峨邊彝族自治州等地進行鄉(xiāng)土核桃種質(zhì)資源調(diào)查評價并收集的185個優(yōu)良單株，用其穗條嫁接而成的。經(jīng)過多年的核桃果實品質(zhì)品鑒，篩選出內(nèi)種皮口感極其苦澀的無性系CZ-301(BI)和內(nèi)種皮口感無苦澀且略帶甘甜的無性系CZ-64(SW)。本試驗即以核桃無性系CZ-64(SW)和CZ-301(BI)的果實為材料，其栽培管理和生境一致。核桃果實成熟時從樹的4個方向各采集20個青果帶回實驗室，去除青皮和種殼，將新鮮的核仁內(nèi)種皮剝下，迅速放入10 mL凍存管中于液氮內(nèi)速凍，共2組3個生物學(xué)重復(fù)，隨后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

將2組生物樣本真空冷凍干燥后，于研磨儀中研磨至粉末狀，稱取100 mg粉末，溶解于0.6 mL體積分?jǐn)?shù)70%甲醇提取液中，4 ℃冰箱過夜，其間渦旋6次。之后將樣品去除，經(jīng)10 000g離心10 min后，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(UPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS，Applied Biosystems 4500 QTRAP)。

液相條件為：采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(1.8 μm×2.1 mm×100 mm)；色譜柱；流動相中水相為超純水加入體積分?jǐn)?shù)0.04%的乙酸，有機相為乙腈加入體積分?jǐn)?shù)0.04%的乙酸。洗脫梯度為：0.00 min，水/乙腈體積比95∶5；10.00 min，水/乙腈體積比5∶95維持1 min；11.10 min，水/乙腈體積比95∶5，維持14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量4 μL。

質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源(ESI)溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣(CUR)30 psi，碰撞誘導(dǎo)電離(CAD)參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿(QQQ)中，每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)進行掃描檢測[26]。

為監(jiān)測質(zhì)譜分析過程中的重復(fù)性，在每10個檢測分析樣本中插入1個質(zhì)控樣本(QC)，由BI和SW組的內(nèi)種皮樣本混合而成(mix)，本試驗中共插入3個。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用軟件Analyst1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，基于自建數(shù)據(jù)庫MVDB及代謝信息公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息進行物質(zhì)定性；以MultiaQuant軟件進行質(zhì)譜峰的積分校正；用R中的內(nèi)置統(tǒng)計prcomp函數(shù)，設(shè)置prcomp函數(shù)參數(shù)scale=True，對數(shù)據(jù)進行unit variance scaling(UV)歸一化處理，并對2組樣本進行主成分(PCA)分析；利用R中的內(nèi)置cor函數(shù)計算皮爾遜相關(guān)系數(shù)r，r越接近1，說明2個重復(fù)樣品相關(guān)性越強；正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)則是先將原數(shù)據(jù)進行l(wèi)og 2轉(zhuǎn)換后，再進行中心化處理(Mean Centering)，利用R中的Metabo-AnalystR包OPLSR.Anal函數(shù)進行分析并得到變量重要性投影值(VIP)，為了避免過擬合，對其進行200個排列的測試以驗證模型準(zhǔn)確性；將差異代謝物含量數(shù)據(jù)采用UV歸一化處理后，通過R中的pheatmap包繪制熱圖，對代謝物在不同樣本間的積累模式進行聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)；同時將得到的差異代謝物映射到KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫，進行相關(guān)通路分析，并通過超幾何檢驗的P值確定其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃內(nèi)種皮澀味物質(zhì)的PCA分析

通過對樣本進行PCA分析，初步了解組間的整體代謝差異和組內(nèi)的重復(fù)穩(wěn)定性。PCA結(jié)果可以顯示樣本間代謝組的分離趨勢，以此來了解樣本間的代謝組差異大小[27]。由圖1可知，各組核桃內(nèi)種皮澀味物質(zhì)之間分離趨勢明顯，說明SW和BI品系在代謝水平上有較大的差異。再通過樣本間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)r觀察到，BI、SW和mix組內(nèi)的r均大于0.9，說明組內(nèi)的重復(fù)樣本相關(guān)性極強、重復(fù)性好，可以用于后續(xù)差異代謝物分析。

圖1 核桃內(nèi)種皮澀味物質(zhì)的PCA得分(左)和相關(guān)性(右)Fig.1 PCA score(left) and correlation(right)of bitter walnut kernel pellicle

2.2 核桃內(nèi)種皮澀味物質(zhì)的OPLS-DA分析

正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)能夠?qū)CA分析中不相關(guān)的差異信息去除，然后篩選差異代謝物。由圖2-a可知，BI和SW在PC1主成分上有明顯的分離，所建的OPLS-DA模型對X和Y矩陣的解釋率分別為0.827(R2X)和1(R2Y)，模型的預(yù)測能力Q2為0.99，這3個指標(biāo)越接近于1，表示模型越穩(wěn)定可靠；Q2>0.9說明此模型為出色的模型，能較好地預(yù)測結(jié)果。為了避免過擬合，對OPLS-DA模型進行n=200的排列驗證，結(jié)果(圖2-b)顯示，經(jīng)過Y置換后模型的R2Y’和Q2’均小于原始模型的R2Y和Q2，說明模型有意義，可根據(jù)變量重要性投影值(VIP)分析篩選差異代謝物。

圖b左上角的注釋為原始模型的R2X、R2Y和Q2，橫坐標(biāo)為模型Y置換后和原始Y之間的相似性，縱坐標(biāo)為R2Y和Q2值The annotations in the upper left corner of Figure b are R2X,R2Y and Q2 of the original model,and the abscissa is the similarity between the replacement of model Y and the original Y,and the vertical axis is R2Y and Q2 values圖2 核桃內(nèi)種皮澀味物質(zhì)的OPLS-DA得分和驗證圖Fig.2 OPLS-DA score and verification of bitter walnut kernel pellicle

2.3 核桃內(nèi)種皮澀味的差異代謝物篩選

基于OPLS-DA結(jié)果，從獲得的多變量分析模型的變量重要性投影值(VIP)初步篩選出不同品種間差異的代謝物。如圖3-a所示，越靠近右上角和左下角的代謝物差異越顯著，紅色為VIP≥1的代謝物。同時結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)值FC(fold change)來進一步篩選差異代謝物，篩選標(biāo)準(zhǔn)為FC≥2和FC≤0.5。如圖3-b所示，從BI和SW 2個品系中共檢測出561種代謝物，篩選出12大類263種差異代謝物。為了方便觀察代謝物變化規(guī)律，將差異代謝物進行歸一化處理并繪制熱圖，結(jié)果如圖4所示。差異代謝物種類由多到少分別是酚酸類、黃酮、脂質(zhì)、其他類、鞣質(zhì)、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、有機酸、生物堿、萜類、木脂素和香豆素、醌類，其中147種上調(diào)，116種下調(diào)。再對代謝物的log2(FC)值排序，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，上調(diào)幅度在前10的差異代謝物分別為：2,4-雙-O-二沒食子?；?1,3,6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(2,4-Bis-O-digallic acyl-1,3,6-tri-O-gallic acyl-β-D-glucose)、2,3-O-二沒食子酰基-1,4,6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(2,3-O-Digalloyl-1,4,6- tri-O-galloyl-β-D-glucose)、3-O-沒食子?；?1,2,4,6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(3-O-Trigalloyl-1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose)、3,4-雙二沒食子?；?1,2,6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(3,4-Bisgallic acyl-1,2,6-tri-O-gallic acyl-β-D-glucose)、二-O-沒食子酸甲酯(Di-O-galloyl Methyl gallate)、四沒食子酸(Tetragallic Acid)、蕓香柚皮苷(Isonaringin)、四-O-沒食子酸甲酯(Tetra-O-galloyl Methyl gallate)、5-沒食子酸(5-Galloylshikimic acid)、松脂醇-己糖(Pinoresinol-Hexose)，其log2(FC)值分別為18.05，17.85，17.71，17.52，15.86，14.08，13.41，12.35，12.13，11.55，有8種酚酸類、1種黃酮、1種木脂素和香豆素。

a為OPLS-DA模型的S形圖，紅點表示代謝物的VIP≥1；b為火山圖，紅點表示上調(diào)的差異代謝物，綠點表示下調(diào)的差異代謝物，灰點為差異不顯著的代謝物a is the S-plot of OPLS-DA model,and red dots indicate that VIP of metabolite is ≥ 1;b is a volcanic map,red dots represent up-regulated differential metabolites,green dots indicate down-regulated differential metabolites,and gray dots represent metabolites without significant difference圖3 核桃內(nèi)種皮澀味的差異代謝物篩選Fig.3 Screening of differential metabolites of bitterness taste in walnut kernel pellicle

由表1還可以看出，下調(diào)幅度在前10的差異代謝物分別為：5-羥基吲哚-3-乙醇(5-Hydroxytryptophol)、丁香酸(Syringic acid)、單酰甘油酯(酰基18∶3)異構(gòu)(2MAG(18∶3)isomer2)、楊梅素-3-O-半乳糖苷(Myricetin 3-O-galactoside)、24,30-二羥基-12(13)烯羽扇豆醇(24,30-Dihydroxy-12(13)-enolupinol)、皂皮酸(Quillaic acid)、DL-泛酰醇(Pantothenol)、木犀草素-6,8-二-C-葡萄糖苷(Luteolin-6,8-di-C-glucoside)、齊墩果酸-3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(Oleanolic acid-3-O-β-D-pyran xylose(1→3)-β-D-pyran glucuronide)、乙酰色氨酸(Acetyltryptophan)，其log2(FC)值分別為-15.88，-13.95，-13.64，-13.39，-13.33，-13.32，-12.79，-12.58，-11.58，-10.72，有2種酚酸類、2種黃酮、2種萜類、1種脂質(zhì)、1種生物堿、1種糖及糖醇、1種氨基酸及其衍生物?？梢娚险{(diào)幅度大的差異代謝物主要為酚酸類和黃酮，而下調(diào)幅度大的差異代謝物則種類較多。

2.4 核桃內(nèi)種皮澀味的差異代謝物通路分析

差異代謝物在生物體內(nèi)相互作用，可將其在KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中進行注釋并富集構(gòu)建相關(guān)代謝途徑[28]。如圖5所示，SW、BI 2種核桃品系內(nèi)種皮中263種顯著差異的代謝物，共注釋到66條代謝通路，其中富集差異代謝物較多且顯著的通路分別是類黃酮代謝、甘油酯代謝、糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定生物合成、抗壞血酸和aldarate代謝、苯丙烷類代謝、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化，富集的差異代謝物主要包括黃酮、酚酸類、脂質(zhì)和有機酸等。

橫坐標(biāo)表示每個通路對應(yīng)的富集因素，縱坐標(biāo)為通路名稱，括號中前面的數(shù)字代表富集的差異代謝物數(shù)，后面的數(shù)字代表P值，其值越小表示富集越顯著 Abscissa represents enrichment factor corresponding to each pathway,the ordinate is pathway name,the number in front of brackets represents the number of enriched differential metabolites,and the number after represents P-value with smaller value indicates more significant enrichment圖5 核桃內(nèi)種皮澀味的差異代謝物KEGG富集結(jié)果Fig.5 KEGG enrichment of differential metabolites of bitterness taste in walnut kernel pellicle

在這些通路中，以類黃酮代謝通路富集差異代謝物最多，且黃酮類物質(zhì)是植物中重要的一類代謝物，種類繁多，KEGG數(shù)據(jù)庫中只包含常見的黃酮類物質(zhì)，許多修飾類物質(zhì)數(shù)據(jù)庫中暫時沒有。因此本研究通過相關(guān)文獻查閱，構(gòu)建了與類黃酮物質(zhì)相關(guān)的代謝途徑——柚皮素代謝途徑，此代謝途徑如圖6所示。由圖6可見，柚皮素、矢車菊素 3-O-葡萄糖苷、圣草酚、圣草酚 7-O-葡糖苷等檢測到的差異代謝物在BI組中顯著表達上調(diào)，其含量分別是SW組的30.08，17.24，4.17，2.13倍。

▲表示代謝物含量在試驗組中顯著上調(diào)，■表示代謝物含量在試驗組中顯著下調(diào)，●表示代謝物被檢測到但未發(fā)生顯著變化，○表示推測的相關(guān)代謝物▲ indicates that metabolite content is significantly up-regulated in experimental group,■ indicates significantly down-regulated.● indicates that metabolite was detected but without significant change, and ○ indicates presumed related metabolite圖6 苦澀味核桃內(nèi)種皮的柚皮素代謝途徑Fig.6 Naringenin chalcone biosynthesis in kernel pellicle of bitter walnut

3 結(jié)論與討論

本試驗采用代謝組學(xué)技術(shù)，以具極苦澀味內(nèi)種皮(BI)和無苦澀味內(nèi)種皮(SW)核桃無性系為材料，分析兩者的代謝物質(zhì)差異，結(jié)果表明，BI和SW組內(nèi)重復(fù)樣本的相關(guān)系數(shù)均在0.90～0.99，重復(fù)性極好，且PCA分析中組間代謝物質(zhì)有明顯差異。從2種類型的核桃內(nèi)種皮中共檢測到561種代謝物，包含34小類不同物質(zhì)，其中差異代謝物有29小類263種，包括147種上調(diào)代謝物和116種下調(diào)代謝物。在上調(diào)差異代謝物中有39種酚酸類(5-沒食子酸、四沒食子酸、綠原酸、新綠原酸、1-咖啡?？鼘幩?、3-氨基水楊酸等)、34種黃酮(柚皮素查爾酮、槲皮素、柚皮素、蕓香柚皮苷、表兒茶素、圣草酚等)、17種脂質(zhì)(溶血磷脂酰乙醇胺、9,10-二羥基-12-十八酸、溶血磷脂酰膽堿等)、16種鞣質(zhì)(木麻黃鞣寧、小木麻黃素、水楊梅丁素等)、12種其他類(三葉豆紫檀苷、磷酸葡糖酸、D-葡萄糖醛酸等)、8種氨基酸及其衍生物(谷胱甘肽、L-亮氨酸、L-(+)-賴氨酸等)、7種有機酸((-)-莽草酸、檸檬酸、β-羥基異戊酸等)、6種核苷酸及其衍生物、5種生物堿和3種木脂素和香豆素。大量研究發(fā)現(xiàn)，澀味是果實重要的內(nèi)在品質(zhì)之一，是由果實內(nèi)部的單寧類物質(zhì)以及其他多酚類化合物引起的[29]。而本研究發(fā)現(xiàn)，BI組中多酚類物質(zhì)(酚酸類、黃酮、鞣質(zhì))占總上調(diào)代謝物的61%，說明多酚類物質(zhì)是引起核桃內(nèi)種皮苦澀味的關(guān)鍵代謝物。這與前人的研究結(jié)果相似，如胡玲等[30]研究桃李果實風(fēng)味物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，綠原酸、新綠原酸、表兒茶素和槲皮素等酚類物質(zhì)與果實的苦澀味密切相關(guān)。Narukawa等[31]研究綠茶中兒茶素的口感特性發(fā)現(xiàn)，兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯等黃酮類組分是傳遞苦澀味的至關(guān)重要物質(zhì)。乜蘭春等[32]采用HPLC研究蘋果苦澀味與酚類物質(zhì)含量的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，果皮中的兒茶素、表兒茶素和槲皮素等酚類物質(zhì)是引起苦味的主要物質(zhì)。Gagne等[33]研究葡萄酒的苦澀味物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，葡萄皮、葡萄籽和葡萄梗中的表兒茶素、表焙兒茶素是形成葡萄單寧的主要前體物質(zhì)，占總酚類物質(zhì)的85%以上。本試驗的BI組中未檢出單寧，但檢測到大量單寧前體物質(zhì)，包括沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、肉桂酸、鞣花酸和香草酸等多種酚酸，可能是由于單寧在提取過程中水解成了多元酚酸和單體酚酸[34]。

代謝物是生物體表型的基礎(chǔ)，能直觀有效地反映生物學(xué)過程及其機理[35]。本試驗通過KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行注釋，共獲得66條代謝通路，其中有6條通路富集的差異代謝物較多且較為顯著，分別是類黃酮代謝、甘油酯代謝、糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定生物合成、抗壞血酸和aldarate代謝、苯丙烷類代謝、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化。苯丙烷類代謝是植物體內(nèi)次生代謝的一條重要途徑，代謝途徑中會產(chǎn)生多種酚酸類、類黃酮、木質(zhì)素等物質(zhì)，為下游次生代謝物質(zhì)的合成提供原料[36-38]。由莽草酸途徑生成的L-苯丙氨酸是此代謝途徑的起始物質(zhì)，在PAL的作用下生成肉桂酸，肉桂酸在C4H作用下生成4-香豆酸，途中產(chǎn)生綠原酸、芥子酸、阿魏酸和咖啡酸等多種酚酸，4-香豆酸在4CL作用下與CoA合成香豆酰CoA，完成苯丙烷類代謝途徑；其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)是此代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它與果實中黃酮類物質(zhì)的合成密切相關(guān)[39-41]。由苯丙烷類代謝形成的終產(chǎn)物香豆酰CoA是類黃酮代謝途徑的起始底物，它在CHS作用下生成四羥基查爾酮，經(jīng)過CHI催化作用生成柚皮素，柚皮素是生成類黃酮物質(zhì)的關(guān)鍵物質(zhì)，可在黃烷酮3-羧化酶、黃烷酮醇還原酶、無色花色素還原酶的作用下生成兒茶素，還可在無色花色素雙加氧酶和花青素還原酶作用下生成表兒茶素。而這2種物質(zhì)是引起澀味的物質(zhì)，也是縮合單寧的前體物質(zhì)[42]。因此，苯丙烷類代謝通路與核桃內(nèi)種皮苦澀味物質(zhì)形成密切相關(guān)。

類黃酮代謝途徑中形成的柚皮素是生成黃酮類化合物的關(guān)鍵初始底物，其在BI組中的含量是SW組的30.08倍，差異極顯著。但KEGG數(shù)據(jù)庫中缺少修飾類黃酮物質(zhì)的信息，無法對柚皮素的下游代謝途徑進行注釋。本試驗通過查閱相關(guān)文獻[43-46]，構(gòu)建了柚皮素的代謝途徑，以柚皮素為底物在不同酶催化下形成柚皮素、圣草酚、槲皮素、花青素、槲皮苷、金圣草素、麥黃酮、圣草酚 7-O-葡糖苷、矢車菊素 3-O-葡萄糖苷等黃酮類化合物，其中柚皮素、圣草酚、圣草酚 7-O-葡糖苷、矢車菊素 3-O-葡萄糖苷上調(diào)表達最為顯著，這些物質(zhì)可作為核桃內(nèi)種皮苦澀味形成的標(biāo)志物，也可為核桃內(nèi)種皮的苦澀味改良提供理論依據(jù)。