大別山牛PAX3基因多態(tài)性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

趙拴平，金 海，徐 磊，李 默，賈玉堂

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點實驗室，安徽 合肥230031)

中國黃牛是世界牛品種資源寶庫的重要組成部分，按照地理分布區(qū)域的不同，分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛3大類[1]。大別山牛是中原黃牛的典型代表，主要分布于安徽省的太湖、岳西、桐城、潛山、金寨、宿松等縣和湖北省大別山西部的黃陂、大悟、麻城等部分地市。長期以來，大別山牛作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要畜力，形成了耐粗飼、抗病力強、肉質(zhì)細膩、善爬坡的優(yōu)良特點，但同時也具有個體小、生長慢等不足。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對大別山牛進行選育具有重要的現(xiàn)實意義。

PAX基因家族普遍存在于各種生物中，編碼128個氨基酸成對結(jié)構(gòu)域，在胚胎細胞的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮著重要作用[2]。PAX3是PAX基因家族成員之一，是肌祖細胞生存、遷移和分化的必需因子[3-4]。在成熟的體細胞中，PAX3基因通過與cis活性因子結(jié)合調(diào)節(jié)Myf5基因的表達，從而參與骨骼肌發(fā)育[4]。此外，PAX3基因可以通過多種途徑促進細胞自我更新，誘導(dǎo)前體細胞發(fā)生定向遷移，促進特定細胞系進行定向分化[5]。在人和小鼠胚胎發(fā)育過程中，PAX3基因在細胞遷移、分化和器官形成中發(fā)揮著重要作用，其變異會引起神經(jīng)嵴細胞功能障礙，進而導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形[6-8]。在禽脊柱發(fā)育過程中，PAX3基因轉(zhuǎn)錄因子對胚胎形態(tài)發(fā)生和細胞分化具有調(diào)節(jié)作用[9]。在哺乳動物中，PAX3基因可以促進羊肌衛(wèi)星細胞的增殖，抑制其分化[10]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，PAX3基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與中國牛早期生長性狀顯著相關(guān)[11]，說明其對牛早期生長發(fā)育具有重要作用，但是否會影響其成年后經(jīng)濟性狀有待進一步研究。為此，本研究采用PCR和測序技術(shù),探究PAX3基因SNPs位點與成年大別山牛群體生長性狀的相關(guān)性，旨在為大別山牛的遺傳選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

292頭體況健康、無親緣關(guān)系、24～48月齡的成年大別山母牛，由國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系合肥綜合試驗站試驗基地安徽省阜陽市潁上縣牛哥牧業(yè)科技有限公司和國家肉牛核心育種場安慶市太湖縣久鴻農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限責(zé)任公司提供。

1.2 樣品采集及體尺指標(biāo)測定

采集試驗牛黃豆大小的耳組織，放入加有體積分數(shù)75%乙醇的離心管中，冷藏于冰盒中帶回實驗室備用。采樣同時測量試驗牛的體斜長、體高、十字部高、胸圍、腹圍、管圍、腰角寬、坐骨端寬等生長性狀數(shù)據(jù)。

1.3 引物設(shè)計與合成

經(jīng)前期試驗初步篩查，牛PAX3基因在試驗群體中僅第4和第6內(nèi)含子存在SNPs位點。以NCBI數(shù)據(jù)庫中牛PAX3基因(GenBank登錄號：NC_007300.6)為模板，利用Primer 5.0軟件設(shè)計針對第4和第6內(nèi)含子的引物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 牛PAX3基因的引物信息Table 1 Primer information for bovine PAX3 gene

1.4 PAX3基因第4內(nèi)含子和第6內(nèi)含子多態(tài)性位點檢測

利用天根生化科技(北京)有限公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)進行牛組織樣基因組提取，將提取好的DNA統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL，冷藏備用。

利用設(shè)計的引物進行PCR擴增，擴增體系為：2×TaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，用ddH2O補充至25.0 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58或65 ℃(具體溫度依引物而定)退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)；72 ℃總延伸5 min。擴增產(chǎn)物用3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結(jié)果利用DNAStar和Mutation Surveyor V4.0.8軟件進行分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)基因型分析結(jié)果，計算基因型頻率和等位基因頻率，利用POPGENE軟件進行哈代-溫伯格平衡檢驗[12]及多態(tài)信息含量(PIC)、遺傳純合度(Ho)、遺傳雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)分析[13-14]；利用Haploview軟件進行多態(tài)位點的連鎖不平衡分析[15]，SHEsis在線軟件進行單倍型分析[16]；采用SPSS 23.0軟件中的GLM模型[17]分析SNPs位點的基因型/單倍型組合與大別山牛群體生長性狀的相關(guān)性，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P<0.05或P<0.01為差異顯著水平進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大別山牛PAX3基因的SNPs位點

對大別山牛PAX3基因第4內(nèi)含子和第6內(nèi)含子區(qū)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果(圖1)顯示，目標(biāo)片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。利用Mutation Surveyor V4.0.8軟件對測序結(jié)果進行分型，結(jié)果(圖2)顯示,第4內(nèi)含子區(qū)存在3個SNPs位點，分別為g.4718G>C、 g.4744T>C和g.4757C>A；第6內(nèi)含子區(qū)只存在1個SNPs位點，為g.78920C>T。

1～11.PCR的擴增片段；M.D2000 Marker1-11.Amplification products；M.Marker D2000

圖2 大別山牛PAX3基因4個SNPs位點圖譜Fig.2 Maps of four SNPs sites of PAX3 gene of DBS cattle

2.2 大別山牛PAX3基因SNPs位點的遺傳參數(shù)

PAX3基因各SNPs位點的基因頻率和基因型頻率分布如表2所示。在隨機挑選的292頭大別山牛群體中，PAX3基因第4內(nèi)含子區(qū)g.4718G>C位點屬于低度多態(tài)(PIC≤0.25)，且處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)，等位基因C的頻率遠高于等位基因G，CC基因型為優(yōu)勢基因型；g.4744T>C位點屬于中度多態(tài)(0.250.05)，等位基因C屬于優(yōu)勢等位基因，TC基因型為優(yōu)勢基因型；g.4757C>A位點屬于中度多態(tài)(0.25T位點屬于中度多態(tài)(0.250.05)，等位基因C屬于優(yōu)勢等位基因，CT基因型為優(yōu)勢基因型。

表2 大別山牛群體PAX3基因SNPs的遺傳參數(shù)Table 2 Genetic parameters of SNPs in PAX3 gene of DBS cattle

2.3 大別山牛PAX3基因SNPs位點的連鎖不平衡和單倍型分析

連鎖不平衡和單倍型分析結(jié)果(表3和表4)顯示，4個SNPs位點間無強連鎖相關(guān)(r2<0.33)，形成13種單倍型，其中頻率大于0.03的單倍型有6個，Hap1和Hap2頻率最高，分別為0.242和0.227。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，6種單倍型形成的單倍型組合均與大別山牛群體的生長性狀無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表3 大別山牛PAX3基因SNPs位點的連鎖不平衡分析Table 3 Estimated values of linkage disequilibrium (LD) analysis between mutation sites in bovine PAX3 gene

表4 大別山牛PAX3基因SNPs位點的單倍型分析Table 4 Haplotypes of PAX3 gene and their frequencies in DBS cattle

2.4 大別山牛PAX3基因SNPs位點多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性

PAX3基因SNPs位點多態(tài)性與大別山牛群體生長性狀的相關(guān)性分析結(jié)果(表5)顯示，4個SNPs位點均與大別山牛群體部分生長性狀顯著(P<0.05)或極顯著相關(guān)(P<0.01)。其中，g.4718G>C位點與大別山牛的十字部高顯著相關(guān)(P<0.05)，GG基因型個體的十字部高顯著優(yōu)于GC和CC基因型個體(P<0.05)。g.4744T>C位點與大別山牛的十字部高、腹圍和腰角寬極顯著相關(guān)(P<0.01)，TT基因型個體的十字部高、腹圍和腰角寬極顯著優(yōu)于TC和CC基因型個體(P<0.01)。

表5 大別山牛PAX3基因SNPs位點多態(tài)性與體尺性狀的相關(guān)性分析Table 5 Association of SNPs polymorphism of PAX3 gene with growth traits of DBS cattle

表5(續(xù)) Continued Table 5

g.4757C>A位點與大別山牛的腰角寬顯著相關(guān)(P<0.05)，CC、CA和AA基因型個體的腰角寬兩兩均差異顯著(P<0.05)，且CC基因型個體優(yōu)于CA和AA基因型個體(P<0.05)。g.78920C>T位點與腹圍極顯著相關(guān)(P<0.01)，與管圍顯著相關(guān)(P<0.05)，TT和CT基因型個體的腹圍均值極顯著優(yōu)于CC基因型個體(P<0.01)，TT基因型個體的管圍均值顯著優(yōu)于CC基因型個體(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)(MAS)在生物育種中發(fā)揮著極其重要的作用，鑒定出一系列與生物表型性狀相關(guān)的DNA分子標(biāo)記[18-19]。PAX基因家族普遍存在于各種生物中，在肌肉生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。PAX3基因突變可造成黑素細胞合成和神經(jīng)嵴發(fā)育異常，從而造成毛發(fā)皮膚低色素、虹膜異色以及顱面骨骼、牙齒及四肢等異常，最終表現(xiàn)為瓦登伯革氏綜合癥[20-21]。在癌癥研究中發(fā)現(xiàn)，PAX3基因參與調(diào)控癌細胞的增值、分化和遷移，沉默PAX3基因能顯著抑制腫瘤生長，降低腫瘤微血管密度，已經(jīng)成為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)記基因之一[22]。在小鼠發(fā)育過程中，PAX3基因通過與Aryl碳氫化合物(AHR)互作抑制環(huán)境對小鼠顱面發(fā)育的影響[23]，通過mTORC1通路作用于肌衛(wèi)星細胞而使其對外界環(huán)境刺激產(chǎn)生防御[24]，通過調(diào)控肌細胞的增殖、分化、遷移等影響小鼠的體質(zhì)量等表型性狀[25]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，PAX3基因g.580T>G、g.4617A>C和 g.79018Ins/del G位點與南陽牛、秦川牛、魯西牛和郟縣紅牛部分體尺性狀顯著相關(guān)[11]。因此研究PAX3基因遺傳變異對我國地方品種大別山牛生長發(fā)育的影響至關(guān)重要。

牛PAX3基因定位于2號染色體體質(zhì)量相關(guān)QTL區(qū)域[26]，其編碼蛋白質(zhì)分布于細胞核中，對細胞遷移、組織器官的分化和形成起著重要的調(diào)控作用。本研究采用PCR和測序技術(shù)首次對292頭大別山牛PAX3基因進行多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個SNPs位點：g.4718G>C、g.4744T>C、g.4757C>A和g.78920C>T。在g.4718G>C、g.4744T>C和g.78920C>T位點，大別山牛群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)，說明群體遺傳未受到人工干預(yù)或未發(fā)生遺傳突變，選擇壓力較小。在g.4757C>A位點，大別山牛群體處于哈代-溫伯格不平衡狀態(tài)(P<0.05)，可能是試驗所選大別山牛群體數(shù)量較少或人工選育對此位點的選擇壓力較大[27-28]。遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，g.4744T>C、g.4757C>A和g.78920C>T位點屬于中度多態(tài)(0.25C位點屬于低度多態(tài)(PIC≤0.25)，說明大別山牛群體在g.4718G>C位點遺傳多樣性較低，在其他3個位點遺傳多樣性豐富。

本研究發(fā)現(xiàn)PAX3基因SNPs位點與大別山牛群體部分體尺性狀具有顯著或極顯著相關(guān)性，這與Xu等[11]的研究結(jié)果一致，進一步證實PAX3基因?qū)ξ覈胤狡贩N牛的生長發(fā)育具有重要影響。然而，本研究中的SNPs位點與Xu等[11]研究中的SNPs(g.580T>G和g.79018Ins/del G)均位于PAX3基因內(nèi)含子區(qū)，不參與轉(zhuǎn)錄過程，遺傳變異不會引起氨基酸改變，這可能與基因內(nèi)含子區(qū)可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的增強子或抑制子影響轉(zhuǎn)錄效率，通過調(diào)節(jié)核小體位置控制DNA結(jié)合而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程有關(guān)[29-30]，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。因此，本研究結(jié)果可以作為PAX3基因影響大別山牛生長發(fā)育的重要證據(jù)之一。