奧貝膽酸關(guān)鍵雜質(zhì)二聚體的合成

舒 兵，鄭 滔，謝曉玲，鄧南翔，張尚師*

（1. 廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2. 廣東藥科大學(xué) 新藥研究中心，廣東 廣州 510006）

奧貝膽酸（obeticholic acid,OCA，圖1）通過激動法尼醇X受體（farnesoid X receptor,FXR），間接抑制細(xì)胞色素7A1（CYP7A1）的基因表達(dá)，抑制膽酸的合成，用以治療對熊去氧膽酸應(yīng)答補(bǔ)加或者無法耐受的原發(fā)性膽汁性膽管炎，具有較高的安全性[1-4]。但是，在生產(chǎn)奧貝膽酸原料藥的過程中，需要將溶液調(diào)至酸性，以促進(jìn)奧貝膽酸的析出。而強(qiáng)酸性環(huán)境可以促進(jìn)奧貝膽酸的羧基和羥基發(fā)生縮合反應(yīng)，可能產(chǎn)生奧貝膽酸二聚體雜質(zhì)，影響其純度和安全性（A-5，圖1）[5-6]。為了更好的控制奧貝膽酸的質(zhì)量，必須對其中的二聚體雜質(zhì)進(jìn)行研究，建立該雜質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，制備該雜質(zhì)作為對照品，用于雜質(zhì)分析和研究，顯得很有必要。

圖1 奧貝膽酸（OCA）和奧貝膽酸二聚體A-5的結(jié)構(gòu)

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的主要方法是將兩分子奧貝膽酸直接在酸性條件下進(jìn)行反應(yīng)，得到的副產(chǎn)物較多、產(chǎn)率低（產(chǎn)率1.9%）、分離困難，難以用于雜質(zhì)研究[7-8]。本研究針對上述合成方法的不足，以二聚體的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，制定了合理的合成路線。以奧貝膽酸為起始原料，分別上芐基保護(hù)基和TMS保護(hù)基，得到了3α，7α-二羥基-6α-乙基-5-β-膽烷酸芐基酯A-1和3α-三甲基硅氧基-7α-羥基-6α-乙基-5-β-膽烷酸A-3兩個(gè)關(guān)鍵中間體。將兩者進(jìn)行縮合反應(yīng)得到酯，然后脫去保護(hù)基，得到奧貝膽酸二聚體A-5（圖2），總收率達(dá)30%。同兩分子奧貝膽酸直接縮合的方法相比，本方法具有產(chǎn)率高、純化方便等優(yōu)點(diǎn)，合成出的二聚體雜質(zhì)，能夠用于奧貝膽酸的質(zhì)量研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南鞏義宇華有限公司）；手提式紫外分析儀（杭州齊威儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化-上海艾朗儀器有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市科瑞儀器有限公司）；Advance Bruker 400M超導(dǎo)核磁共振波譜儀（瑞士BRUKER公司）；Thermo超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司）。

主要試劑：奧貝膽酸、溴化芐（薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；4-二甲氨基吡啶、三甲基氯硅烷（上海畢得醫(yī)藥有限公）；碳酸鉀、DMF、三乙胺、二環(huán)己基碳二亞胺（上海泰坦科技有限公司），其他試劑均為市售分析純。

1.2 合成實(shí)驗(yàn)操作

1.2.1 3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽烷酸芐基酯（A-1）的合成

于250 mL圓底燒瓶中，加入奧貝膽酸（OCA,5.0 g,11.0 mmol），溴化芐（3.1 g,17.85 mmol,1.5 eq），無水碳酸鉀（2.5 g,17.85 mmol,1.5 eq），最后加入無水DMF（80 mL），將反應(yīng)體系于60℃下攪拌20 h。反應(yīng)畢，停止反應(yīng)，放冷至室溫，倒入含有100 mL冰水和100 mL的乙酸乙酯EA混合溶液中，攪拌5分鐘后，加硅藻土過濾，濾液分液，水層加30 mL EA萃取兩次，合并有機(jī)層，加飽和食鹽水Brine（50 mL）洗二次，無水硫酸鈉干燥后過濾，濾液旋干得粗品，加硅膠柱層析（PE/EA＝10/1～4/1），得到中間體A-1。

1.2.2 3α-三甲基硅氧-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷酸芐基酯（A-2）的合成

于250 mL圓底燒瓶中，加入中間體A-1（3.0 g,5.88 mmol）和甲苯（80 mL），將反應(yīng)體系于0℃下攪拌10 min后，先后滴加三甲基氯硅烷（1.4 g,12.94 mmol,2.2 eq）和三乙胺（2.4 g,23.53 mmol,4.0 eq），將反應(yīng)體系于60℃油浴中攪拌過夜。反應(yīng)畢，停止反應(yīng)，放冷至室溫，倒入含有80 mL冰水和80 mL的EA混合溶液中，攪拌5 min后，分液，水層加20 mL EA萃取三次，合并有機(jī)層，加Brine（50 mL）洗二次，無水硫酸鈉干燥后過濾，濾液旋干得粗品，加硅膠柱層析（PE/EA＝40/1～10/1），得到中間體A-2。

1.2.3 3α-三甲基硅氧-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷酸（A-3）的合成

于100 mL圓底燒瓶中，加入中間體A-2（2.0 g,3.06 mmol）和無水乙酸乙酯（60 mL），加入濕鈀碳（100 mg,10%含量），反應(yīng)體系換H2，置換5次，于室溫下，氫氣環(huán)境中攪拌2 h，反應(yīng)畢，停止反應(yīng)，加硅藻土過濾，濾液旋干，得A-3粗品，無需純化，直接投下一步反應(yīng)。

1.2.4 3α-{3-[3α-羥基-7α-三甲基硅氧-6α-乙基-5β-孕甾烷-20-基]-丙酰氧基}-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷酸芐基酯（A-4）的合成

于100 mL三頸燒瓶中，加入中間體A-1（1.0 g,1.96 mmol），中間體A-3（1.2 g,2.15 mmol,1.1 eq），二環(huán)己基碳二亞胺（DCC,0.6 g,2.94 mmol,1.5 eq）和4-二甲氨基吡啶（DMAP,23.9 mg,0.2 mmol,0.1 eq），將體系換N2保護(hù)，換氣三次，加入50 mL重蒸二氯甲烷，將反應(yīng)體系于室溫中攪拌3小時(shí)。反應(yīng)畢，停止反應(yīng)，加入50 mL冰水，攪拌10分鐘后過濾。濾液分液，水層加20 mL二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)層，加Brine洗一次，無水硫酸鈉干燥后過濾，濾液旋干得粗品，加硅膠柱層析（PE/EA＝40/1～10/1），得到中間體A-4。

1.2.5 3α-{3-[3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-孕甾烷-20-基]-丙酰氧基}-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷酸（A-5）的合成

稱取A-4（180 mg,0.183 mmol）于100 mL反應(yīng)瓶中，加15 mL乙酸乙酯溶解，加入20 mg Pd/C，H2換氣三次后室溫?cái)嚢? h后，濾去Pd/C，往濾液中加入10 mL乙酸乙酯和10 mL水，滴加0.3 mL濃鹽酸，室溫?cái)嚢璋雮€(gè)小時(shí)，反應(yīng)完畢，分液，水層加10 mL EA萃取一次，合并EA層，飽和食鹽水洗一次后無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液旋干，硅膠柱分離得到奧貝膽酸二聚體A-5。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成路線

本研究采用逆合成分析法分析奧貝膽酸二聚體雜質(zhì)的合成路線。將奧貝膽酸二聚體拆分為兩分子的奧貝膽酸，分別對奧貝膽酸的羥基基團(tuán)和羧基基團(tuán)予以保護(hù)，得到一分子羥基保護(hù)基的奧貝膽酸和一分子羧基保護(hù)的奧貝膽酸羧酸酯，通過酯縮合、脫保護(hù)得到奧貝膽酸二聚體。首先，將奧貝膽酸在碳酸鉀條件下與溴芐發(fā)生親核反應(yīng)得到奧貝膽酸芐酯A-1。接著與三甲基氯硅烷（TMS-Cl）反應(yīng)得到TMS保護(hù)的TMS奧貝膽酸芐酯A-2，經(jīng)氫氣鈀碳體系還原，得到TMS奧貝膽酸A-3。TMS奧貝膽酸與奧貝膽酸芐酯在DCC/DMAP體系下發(fā)生酯縮合反應(yīng)得到奧貝膽酸二聚體前體A-4，最后經(jīng)氫氣鈀碳體系還原、酸性條件下脫芐基和TMS保護(hù)基得到目標(biāo)產(chǎn)物奧貝膽酸二聚體A-5（圖2）。

圖2 奧貝膽酸二聚體A-5的合成路線

2.2 3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽烷酸芐基酯（A-1）的分析數(shù)據(jù)

參照實(shí)驗(yàn)操作“1.2.1”，得到4.2 g白色固體A-1，產(chǎn)率87%，mp:54.1～57.6℃，1H-NMR（400 MHz,CDCl3）δ7.40～7.32 (m,5H),5.14 (s,2H),3.76～3.69 (m,1H),3.49～3.36 (m,1H),2.48～2.37 (m,1H),2.35～2.24 (m,1H),2.00～1.94 (m,1H),1.91～1.75 (m,6H),1.71～1.58 (m,3H),1.51～1.46 (m,2H),1.45～1.42 (m,2H),1.42～1.38 (m,4H),1.36～1.31 (m,2H),1.31～1.25 (m,2H),1.20～1.17 (m,1H),1.16～1.13 (m,1H),1.08～0.98 (m,1H),0.96～0.90 (m,10H),0.66 (s,3H). ESI-MS (m/z) 511.4 [M + H]+。

2.3 3α-三甲基硅氧-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷酸芐基酯（A-2）的分析數(shù)據(jù)

參照實(shí)驗(yàn)操作“1.2.2”，得到2.9 g白色固體A-2，產(chǎn)率76%，mp:72.3～75.9℃，1H-NMR（400 MHz,CDCl3）δ7.40～7.32 (m,5H),5.14 (s,2H),3.72 (s,1H),3.49～3.36 (m,1H),2.43 (ddd,J＝15.1,9.9,5.0 Hz,1H),2.35～2.24 (m,1H),2.00～1.94 (m,1H),1.91～1.75 (m,6H),1.65～1.63 (m,3H),1.48～1.47 (m,2H),1.45～1.42 (m,2H),1.39 (t,J＝5.9 Hz,4H),1.33 (d,J＝3.5 Hz,2H),1.31～1.25 (m,2H),1.18 (s,1H),1.15 (s,1H),1.04～1.01 (m,1H),0.93 (s 9H),0.66 (s,3H). ESI-MS (m/z) 583.2 [M + H]+。

2.4 3α-{3-[3α-羥基-7α-三甲基硅氧-6α-乙基-5β-孕甾烷-20-基]-丙酰氧基}-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷酸芐基酯（A-4）的分析數(shù)據(jù)

參照實(shí)驗(yàn)操作“1.2.4”，得到1.4 g白色固體A-4，兩步產(chǎn)率69%，mp:88.6～91.2℃，1H-NMR（400 MHz,CDCl3）δ7.40～7.33 (m,5H),5.14 (s,2H),4.64～4.50 (m,1H),3.71 (d,J＝12.0 Hz,2H),3.47～3.36 (m,1H),2.43 (ddd,J＝14.9,9.8,4.9 Hz,1H),2.33 (ddd,J＝12.8,9.4,5.6 Hz,2H),2.25～2.13 (m,1H),1.95 (ddd,J＝17.9,10.9,4.2 Hz,5H),1.85 (dd,J＝17.5,14.2 Hz,9H),1.63 (ddd,J＝17.0,10.8,9.3 Hz,8H),1.49～1.29 (m,21H),1.17 (dd,J＝21.0,11.6 Hz,8H),0.97～0.87 (m,20H),0.66 (d,J＝1.9 Hz,6H),0.13 (s,9H). ESI-MS (m/z) 985.8 [M + H]+。

2.5 3α-{3-[3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-孕甾烷-20-基]-丙酰氧基}-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷酸（A-5）的分析 數(shù)據(jù)

參照實(shí)驗(yàn)操作1.2.5，得到97.3 mg A-5，產(chǎn)率65%，mp:193.9～196.5℃，1H-NMR (400 MHz,MeOD)δ4.59～4.44 (m,1H),3.70～3.66 (m,2H),3.39～3.29 (m,2H),2.43～2.28 (m,2H),2.29～2.15 (m,2H),2.13～1.97 (m,3H),1.96～1.73 (m,13H),1.71～1.62 (m,1H),1.63～1.44 (m,13H),1.42～1.26 (m,11H),1.26～1.08 (m,7H),1.07～1.01 (m,1H),1.00～0.95 (m,8H),0.95～0.89 (m,10H),0.72 (s,3H),0.71 (s,3H).13C-NMR (101 MHz,MeOD)δ176.77,174.38,78.18,77.86,77.53,75.08,71.82,69.88,69.67,55.99,55.93,50.28,45.52,45.35,42.42,42.39,41.74,41.67,40.16,40.13,39.64,39.63,35.45,35.39,35.34,35.30,35.24,35.02,33.21,33.13,33.02,31.38,31.01,30.97,30.67,29.90,29.29,27.95,26.51,23.25,23.22,22.57,22.42,22.13,22.08,20.65,17.60,17.57,11.10,11.03,10.80,10.78. ESI-MS (m/z) 821.5 [M - H]+。結(jié)果與參考文獻(xiàn)一致[7]。

3 結(jié)論

本研究以奧貝膽酸為起始原料，經(jīng)過上芐基酯化、TMS保護(hù)羥基、氫氣鈀碳體系脫芐基、酯縮合、脫保護(hù)等步驟合成得到了奧貝膽酸關(guān)鍵雜質(zhì)二聚體A-5，總收率為30%。該雜質(zhì)經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS等確證了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。同兩分子奧貝膽酸直接反應(yīng)相比，該方法具有產(chǎn)率高、純化方便等優(yōu)點(diǎn)。本研究合成出純度較高的奧貝膽酸二聚體雜質(zhì)，能夠用于奧貝膽酸的質(zhì)量分析和建立奧貝膽酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具有較好的應(yīng)用前景。