復(fù)制因子C4在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后相關(guān)性研究

劉賓 劉輝 李寶玉

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院胃腸外科300211

0 引言

胰腺癌是全球第七大癌癥致死原因，在美國(guó)的惡性腫瘤中，其死亡率高居第三位[1]。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的估計(jì)，2020年美國(guó)有576 00例新發(fā)胰腺癌病例，導(dǎo)致近47 050例死亡[2]。據(jù)預(yù)測(cè)，胰腺癌將在2030年左右成為美國(guó)癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[3]。胰腺導(dǎo)管腺癌是最常見(jiàn)、最致命的胰腺癌亞型，占總診斷病例的90%以上[3]。由于缺乏顯著的早期癥狀，大多數(shù)胰腺導(dǎo)管腺癌在確診時(shí)往往處于晚期（Ⅲ或Ⅳ期），此時(shí)治療效果較差。此外，胰腺導(dǎo)管腺癌是一種侵襲性極高的惡性腫瘤，手術(shù)后易復(fù)發(fā)。并由于化療耐藥性的存在，現(xiàn)有療法對(duì)于提高患者預(yù)后，效果甚微[4]。靶向治療與免疫治療盡管效果初現(xiàn)端倪，但仍需發(fā)現(xiàn)更多更有效的治療靶點(diǎn)。胰腺癌的早期診斷至關(guān)重要，目前的主要標(biāo)記物包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類(lèi)抗原199（carbohydrate antigen199，CA199）、CA242等，一定程度上起到了預(yù)測(cè)胰腺癌的作用，但其特異性仍有待提高[5]。為了提高胰腺癌的早期診斷率，仍需發(fā)現(xiàn)更多且更加特異的胰腺癌生物標(biāo)記物。

復(fù)制因子C（replication factor C，RFC）家族是由RFC1、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5亞基組成的復(fù)合物，是DNA聚合酶的引物識(shí)別因子[6-11]。RFC在多種惡性腫瘤中具有生物活性，可能在癌細(xì)胞的增殖、進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[12-13]。根據(jù)腫瘤的細(xì)胞和組織學(xué)特征，其可以作為癌基因或抑癌基因。RFC4是一個(gè)主要存在于細(xì)胞核中，相對(duì)分子質(zhì)量為37 000的調(diào)控蛋白[7，14-15]。RFC4主要存在于DNA的RFC復(fù)合體中，能夠參與DNA復(fù)制復(fù)合體的形成，起始DNA的復(fù)制過(guò)程[7，16-17]。另外，RFC4還參與多種重要的細(xì)胞過(guò)程，包括DNA鏈延伸、DNA修復(fù)、磷酸肌醇相關(guān)信號(hào)通路等[6，12，18]。

RFC4在腫瘤中的作用已被多項(xiàng)研究證實(shí)[12-13]。在此前一項(xiàng)研究中，研究者通過(guò)全基因組RNAi篩選，發(fā)現(xiàn)RFC4可通過(guò)促進(jìn)非同源端連接修復(fù)介導(dǎo)結(jié)直腸癌放療耐受[19]。也有研究結(jié)果證實(shí)，RFC4的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)，可用于結(jié)直腸癌的預(yù)后預(yù)測(cè)[13]。研究者通過(guò)生物信息分析，證實(shí)RFC4是肝癌的潛在治療靶點(diǎn)[12]。然而，RFC4對(duì)于胰腺癌這種高惡性程度腫瘤的潛在影響仍然未知。

本研究中，旨在探討RFC4在胰腺導(dǎo)管腺癌組織及相應(yīng)正常組織中的相對(duì)表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系，有助于更好地認(rèn)識(shí)RFC4在胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)展中的作用機(jī)制，從而對(duì)研究胰腺導(dǎo)管腺癌的治療與預(yù)后預(yù)測(cè)方法有重要意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年6月至2017年9月，天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)治療的胰腺導(dǎo)管腺癌患者76例。其中，男性44例，女性32例，年齡57.5歲±3.25歲。全部病例均經(jīng)過(guò)病理證實(shí)，術(shù)前未經(jīng)化療或放療，且具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分級(jí)和腫瘤大小等；收集患者的腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本。在76例病例中，腫瘤分級(jí)低級(jí)別者35例，高級(jí)別者41例；腫瘤大小<4 cm者28例，≥3.5 cm者48例。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究已通過(guò)天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核。

1.2 主要材料與儀器

RFC4兔抗人單克隆抗體（a b156780，英國(guó)Abcam公司），二抗免疫組化試劑盒（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司），二氨聯(lián)苯胺（diamiobenzidine，DAB）顯色試劑盒（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）。

RM2235型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法

對(duì)76例胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤組織及癌旁正常組織行福爾馬林固定，石蠟包埋，包埋后蠟塊標(biāo)本進(jìn)行3μm切片，然后行RCF4免疫組化染色。將切片在75℃環(huán)境中孵育30 min，隨后用二甲苯脫蠟，并用梯度乙醇溶液（100%，100%，95%，85%，75%）水合。水合完畢后使用檸檬酸緩沖液孵育20 min修復(fù)抗原，并阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶5 min。隨后用質(zhì)量濃度為50 g/L的牛血清白蛋白（b ovine serum albumin，BS A）封閉液封閉30 min。封閉后使用RFC4抗體孵育2 h。然后，切片用生物素化的二抗孵育1.5 h，通過(guò)DAB法顯色，蘇木素染色細(xì)胞核。免疫組化切片于顯微鏡下觀察，觀察倍率為100和200倍，期間拍照并采集圖像。根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性染色百分率和染色強(qiáng)度綜合評(píng)價(jià)免疫組化結(jié)果。

染色結(jié)果表明，RCF4蛋白呈顯著的核定位。每例患者的腫瘤組織及癌旁組織切片選取6個(gè)視野進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果采用雙盲法判斷，依照陽(yáng)性細(xì)胞在總細(xì)胞數(shù)中的比例進(jìn)行評(píng)定。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)<10%時(shí)，記0分；10%～30%時(shí)，記1分；30%～60%時(shí)，記2分；>60%時(shí)，記3分。陽(yáng)性染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性染色記0分；弱陽(yáng)性染色記1分；中陽(yáng)性染色記2分；強(qiáng)陽(yáng)性染色記3分。以陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分的和判斷表達(dá)情況，總分為0～2分為RFC4低表達(dá)，3～6分為RFC4高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。通過(guò)基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析RCF4的mRNA在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)。通過(guò)ProteinAtlas數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000104738-RCF4/tissue）分析不同腫瘤組織中RCF4的表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性，并通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)比較RCF4不同表達(dá)組胰腺導(dǎo)管腺癌患者的總生存及無(wú)病生存率差異（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=RCF4）。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，通過(guò)卡方檢驗(yàn)比較臨床病理特征與患者胰腺導(dǎo)管腺癌組織RFC4表達(dá)之間的相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RFC4的生物信息學(xué)分析結(jié)果

通過(guò)ProteinAtlas數(shù)據(jù)庫(kù)分析了RCF4的mRNA水平在不同腫瘤中與患者生存率間的相關(guān)性。結(jié)果表明，RCF4的mRNA水平與多種腫瘤患者的生存期之間具有相關(guān)性，包括腎癌、肝癌、胰腺癌及宮頸癌，提示RCF4可作為多種腫瘤預(yù)后的預(yù)測(cè)因子（圖1）。

圖1 復(fù)制因子C4（RCF4）在不同腫瘤組織中與患者預(yù)后間的關(guān)聯(lián)

通過(guò)GPEIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了RCF4的mRNA水平在179例人胰腺導(dǎo)管腺癌組織及171例對(duì)應(yīng)的正常組織中的差異，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中RCF4的mRNA呈顯著高表達(dá)（圖2，P<0.05）。此外，通過(guò)GPEIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析探討了RCF4的表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后的潛在關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，RCF4的表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的總生存率（P=0.046）及無(wú)病生存率（P=0.042）均具有顯著的相關(guān)性（圖3）。該結(jié)果提示，RCF4的表達(dá)與患者的預(yù)后顯著相關(guān)。

圖2 胰腺導(dǎo)管腺癌中復(fù)制因子C4（RCF4）的mRNA表達(dá)

圖3 復(fù)制因子C4（RCF4）表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者生存率的相關(guān)性

2.2 RFC4在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)

通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了RFC4在76例行手術(shù)切除的胰腺導(dǎo)管腺癌患者的腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中RFC4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，RFC4呈顯著核定位，且與癌旁組織相比，RFC4蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈顯著高表達(dá)（圖4）。

圖4 胰腺導(dǎo)管腺癌組織和癌旁正常組織中復(fù)制因子C4（RCF4）的免疫組化結(jié)果

2.3 RFC4蛋白表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的臨床病理特征相關(guān)性

為了進(jìn)一步明確RFC4在胰腺導(dǎo)管腺癌患者中的臨床意義，分析比較了RFC4與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的臨床病理特征之間的相關(guān)性。比較了RFC4低表達(dá)組與高表達(dá)組胰腺導(dǎo)管腺癌患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分級(jí)及腫瘤大小。結(jié)果表明，RFC4的表達(dá)水平與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的腫瘤大小（P=0.038）顯著相關(guān)，而與年齡（P=0.642）、性別（P=0.804）、腫瘤分級(jí)（P=0.902）的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 復(fù)制因子C4（RFC4）蛋白表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

胰腺癌的發(fā)病率及死亡率均居高不下，主要原因是其缺乏顯著的早期癥狀，進(jìn)展迅速，且缺乏有效的治療手段[20]。因此，胰腺癌的早期診斷至關(guān)重要。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一系列胰腺癌靶點(diǎn)，如CA199、CA242等，在一定程度上提高了胰腺癌的早期診斷率，但這些生物標(biāo)記物均仍有一定的局限性[21]。部分胰腺癌患者的CA199水平并未升高，主要由于少數(shù)人群不表達(dá)CA199，并且在部分情況下CA199會(huì)與體液中的某些抗體形成免疫復(fù)合物，導(dǎo)致CA199無(wú)法檢測(cè)[19]。CA242的敏感性較CA199略低。這兩種指標(biāo)雖然可作為胰腺癌的預(yù)測(cè)依據(jù)，但仍需結(jié)合影像學(xué)檢查加以確診[22]。為了提高胰腺癌的早期診斷率，仍需發(fā)現(xiàn)更有效、更敏感的胰腺癌生物標(biāo)記物。在本研究中，發(fā)現(xiàn)RFC4在人胰腺導(dǎo)管腺癌組織中顯著高表達(dá)，并與患者的預(yù)后及腫瘤大小顯著相關(guān)，提示RFC4可作為胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后預(yù)測(cè)因子和生物標(biāo)記物。

通過(guò)對(duì)76例人胰腺導(dǎo)管腺癌組織和癌旁正常組織RFC4染色強(qiáng)度的免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)相較于癌旁正常組織，RFC4在腫瘤組織中高表達(dá)。臨床病理分析顯示，RFC4表達(dá)與腫瘤大小密切相關(guān)，提示RFC4在胰腺導(dǎo)管腺癌的增殖及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。RFC4除了在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中異常表達(dá)外，其高表達(dá)也發(fā)生在一些實(shí)體瘤中，如結(jié)直腸癌及肝癌等，并與不良預(yù)后密切相關(guān)[13]。RFC4通過(guò)促進(jìn)DNA非同源末端連接修復(fù)，降低結(jié)直腸癌患者的放療敏感性[2]。而到目前為止，RFC4對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用尚未被廣泛揭示，它是否在大多數(shù)腫瘤中具有功能，及其對(duì)預(yù)后的影響尚不明晰。在本研究中，初步分析了RFC4在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)，并分析了其與胰腺導(dǎo)管腺癌患者臨床特征的關(guān)系及其對(duì)預(yù)后的影響，提示RFC4可能是胰腺導(dǎo)管腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子和潛在的治療靶點(diǎn)。但是，上述結(jié)論需要利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，分析RFC4對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌相關(guān)細(xì)胞功能的影響。

研究結(jié)果表明，RFC4對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鏈斷裂（double strand break，DS B）有重要影響[7，23-24]。細(xì)胞內(nèi)存在兩種主要的DSB修復(fù)方式：非同源末端鏈接（non-homologous end joining,NHE J）和同源重組（homologous recombination，HR）[25]。而在針對(duì)結(jié)直腸癌的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)敲低RFC4顯著降低了NHEJ的活性[13]。在本項(xiàng)研究中，證實(shí)了RFC4在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中存在高表達(dá)，并提示不良預(yù)后，其極有可能參與腫瘤進(jìn)展。因此，需要進(jìn)一步開(kāi)展機(jī)制研究，研究RFC4是否可通過(guò)對(duì)DSB的修復(fù)，影響胰腺導(dǎo)管腺癌的進(jìn)展。

RFC4對(duì)于DNA復(fù)制具有重要的調(diào)控作用，而這進(jìn)一步會(huì)影響細(xì)胞的周期及增殖進(jìn)程[8]。RFC4的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致DNA復(fù)制的異常，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖并引發(fā)腫瘤[26]。因此，在未來(lái)的研究中需要闡明在胰腺導(dǎo)管腺癌中，RFC4的下調(diào)是否會(huì)導(dǎo)致DNA復(fù)制及細(xì)胞增殖的異常，從而闡明RFC4對(duì)于腫瘤發(fā)展及患者預(yù)后影響的調(diào)控機(jī)制。已有多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)了RFC4作為腫瘤治療靶點(diǎn)的可能性，結(jié)合本研究成果，進(jìn)一步提示了RFC4可作為多種腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。

本研究的結(jié)果表明，RFC4的mRNA在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中顯著高表達(dá)，且其表達(dá)與患者的總生存率與無(wú)病生存率相關(guān)；RFC4蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中高表達(dá)，并與患者的腫瘤大小顯著相關(guān)。本研究結(jié)果提示，RFC4可作為胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后預(yù)測(cè)因子和潛在的生物標(biāo)記物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突