生物炭與干旱脅迫對接種紫花苜蓿光合效率及生長的影響

李鵬珍， 趙得琴,2， 鄧 波*， 楊 軍， 趙國華， 趙 亮

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100193； 2.寧夏回族自治區(qū)百辰產(chǎn)業(yè)投資有限公司， 寧夏 銀川 750001；3.烏魯木齊綠之園園林開發(fā)有限公司， 新疆 烏魯木齊 830000； 4.特克斯縣林業(yè)和草原局濕地保護(hù)站， 新疆 特克斯 835500)

水分不僅是限制地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因子之一，也是畜牧業(yè)和經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重要保障，是不可替代的自然資源[1-3]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)被譽為“牧草之王”，是世界上廣泛種植的豆科牧草，具有營養(yǎng)價值高、耐刈割、產(chǎn)量高和適應(yīng)性強等特點。紫花苜蓿的生長受干旱脅迫影響較大，對干旱脅迫響應(yīng)迅速，大多數(shù)地區(qū)種植紫花苜蓿需要灌溉維持[4]。近年來，關(guān)于苜蓿抗旱性研究主要集中于耐旱品種選育[5]、生物育種技術(shù)[6-7]、接種耐旱根瘤菌[8-9]等方面。目前，在抗旱品種選育方面一直存在耐旱、高產(chǎn)很難同時達(dá)到的現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)也存在轉(zhuǎn)化效率低、遺傳不穩(wěn)定、研究進(jìn)展不均衡等問題[10-11]。張淑卿等[12]研究發(fā)現(xiàn)，接種耐旱根瘤菌可提高植株抗旱能力，增加產(chǎn)量，為干旱地區(qū)植被的增產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。Sameh S A等[13]的研究也表明接種耐旱根瘤菌可以提高大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)耐旱性能。但是，根瘤菌基因突變快，土著菌競爭能力較強，僅依靠接種根瘤菌已不能解決因干旱帶來的問題[14]。因此，改良生態(tài)環(huán)境、土壤結(jié)構(gòu)和保持土壤肥力已成為現(xiàn)階段學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點。

生物炭具有含碳率高、孔隙結(jié)構(gòu)豐富、理化性質(zhì)穩(wěn)定等特點，這些特點也是生物炭能夠還田改土、提高農(nóng)作物產(chǎn)量、實現(xiàn)碳封存的重要基礎(chǔ)[15]。生物炭增產(chǎn)效應(yīng)已在水稻(OryzasativaL.)、辣椒(CapsicumannuumL.)、玉米(ZeamaysL.)等植物上得到驗證[16-18]。光合作用是植物生長最重要的生理過程之一，研究植物的光合特性是研究植物適應(yīng)其生存環(huán)境機(jī)制的有效途徑[19]。干旱會使植物光合作用終止，新陳代謝紊亂，最終導(dǎo)致其死亡[20]。有研究表明，生物炭能夠緩解干旱脅迫對植物光合作用的影響，能夠提高花生(ArachishypogaeaLinn.)葉片光合速率和光系統(tǒng)II(PSII)的最大電子傳遞速率，增加花生莢果產(chǎn)量[21-22]。Abideen等[23]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)生物炭改良后土壤持水量增加，植物水分利用狀況得到改善，導(dǎo)致凈光合速率增加，提高了光系統(tǒng)II的能源利用效率，促進(jìn)了植物生長。Alharby等[24]也發(fā)現(xiàn)，生物炭的添加可以減輕干旱脅迫對玉米水分利用效率方面產(chǎn)生的負(fù)面影響。Lehmann等[25]認(rèn)為在土壤中施用生物炭是一種減少土壤氮素?fù)p失、提高氮肥利用率的有效方法。目前，關(guān)于生物炭添加對干旱脅迫下紫花苜蓿光合作用及生長影響的報道甚少。本試驗在干旱脅迫條件下，通過在土壤中添加不同水平生物炭，研究接種根瘤菌后紫花苜蓿的凈光合速率、葉綠素含量、生物量和葉面積等的變化，探究干旱脅迫下施加生物炭對接種根瘤菌紫花苜蓿光合特性和生長的影響，以期為紫花苜?？购翟耘嗉捌渖硌芯刻峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為紫花苜蓿(‘中苜一號’)。供試土壤取自河北省涿州市中國農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗示范基地，土壤類型為砂壤土，有機(jī)碳含量為0.059%，全氮含量為0.65%，全磷含量為0.93%，pH值為7.51，田間持水量為23%。根瘤菌為綠色熒光蛋白標(biāo)記的中華苜蓿根瘤菌‘Sm1021’菌株(gfp-Sm1021)。玉米秸稈生物炭由遼寧市金和福生物炭科技有限公司提供，生物炭的基本理化性質(zhì)如表1所示。

表1 生物炭的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of biochar 單位：g·kg-1

1.2 試驗方法

挑取中華苜蓿根瘤菌‘Sm1021’菌株的單菌落，接種至TY液體培養(yǎng)基(硫酸鏈霉素400 mg·L-1、壯觀霉素80 mg·L-1)，溫度為28℃，180 rmp振蕩培養(yǎng)48 h。然后選100粒籽粒飽滿的紫花苜蓿種子，用75%的酒精浸泡3 min后用無菌水沖洗3次，再用消毒液浸泡2 min，用無菌水再次沖洗。最后置于人工氣候培養(yǎng)箱中于26℃，光照16 h，黑暗8 h的條件下培養(yǎng)5 d后進(jìn)行移栽。移栽時將幼苗放在苗床上的目標(biāo)位置，挖去少量的淺層土壤，然后用移液槍移取100 uL的根瘤菌液接種在所移栽的幼苗根部，在保持根系完整的前提下將被挖去的淺層土壤填入根系周圍，每個花盆移栽6株。

風(fēng)干土和玉米秸稈生物炭過2 mm篩，經(jīng)高溫高壓(121℃，103 KPa)滅菌2 h后，分裝到花盆中，每個花盆中裝入1 300 g土，玉米秸稈生物炭與土壤按2%，1.5%，1%，0.5%，0%的配比混勻，每種配比24盆，在生長期間按常規(guī)進(jìn)行統(tǒng)一管理，定期定量供水，澆水量為最大田間持水量的75%～80%(土壤基質(zhì)田間持水量為23%，土壤最大田間持水量為100%時的凈含水量為23%)。

在各生物炭水平上進(jìn)行干旱處理，每個處理6盆。從移栽之日起，每兩天稱重并澆一次蒸餾水。試驗共設(shè)4個水分梯度，正常水分處理為最大田間持水量的75%～80%(W0)，輕度干旱脅迫為最大田間持水量的55%～60%(W1)，中度干旱脅迫為最大田間持水量的35%～40%(W2)，重度干旱脅迫為最大田間持水量的15%～20%(W3)，自干旱脅迫之日起，每天稱重并澆灌一次蒸餾水，嚴(yán)格保持干旱梯度，干旱處理28 d后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1光合特性的測定 葉面積：采用方格紙法測定葉面積，每1個處理中選取4個植株，取出從植株頂端依次向下數(shù)的第3個葉片。將選好的葉片放在單位面積為1 mm×1 mm的方格紙上，用相機(jī)進(jìn)行拍照，保證葉片的完整度，根據(jù)葉片所占方格面積計算出苜蓿的葉面積[26]。

葉綠素含量：采用丙酮乙醇混合法測定[27]。稱取0.1 g新鮮苜蓿葉片，用去離子水清洗干凈，用剪刀將葉片剪成1～2 mm寬的細(xì)條，放入50 ml進(jìn)口離心管中，加入10 ml 80%的丙酮溶液和5 ml 95%的乙醇溶液，擰緊蓋子，在室溫下黑暗處靜置8～12 h，待葉片變白后，取上清液分別在663 nm和645 nm波長下測定吸光度值，并按以下公式計算葉綠素含量：

葉綠素含量(mg·g-1)=(8.05A663+20.29A645)×V/1 000 W

公式中：A663，A645分別指葉綠素提取液在663 nm和645 nm處的吸光度值

V—提取液體積(mL)

W—葉片重(g)

光合效率：使用便攜式光合儀(Li-6400，美國)測定紫花苜蓿葉片凈光合速率(Photosynthetic rate,Pn)、細(xì)胞間隙CO2濃度(CIntercellular CO2concentration,Ci)、氣孔導(dǎo)度(Stomatal conductance,Gs)、蒸騰速率(Transpiration rate,Tr)。每個處理選擇3株植物，每株植物選取1片位于分蘗上兩層且完全展開的健康葉片，測量時取葉片中間部位置于葉室，并做好標(biāo)記，每個葉片重復(fù)測3次。使用Li-6400 File Exchange 2.04分析軟件得到各處理的光合參數(shù)[28]。

1.3.2生物量的測定 處理28 d后，從每種處理中隨機(jī)選出3個植株，將植株地上、地下部分離，分別裝在紙袋中，將分裝好的樣品放在105℃的烘箱中殺青10 min，然后將烘箱溫度降至65℃烘干，冷卻后稱重[29]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析(One-way Anova)進(jìn)行處理間差異比較，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。采用Person相關(guān)分析紫花苜蓿生物量與各光合指標(biāo)之間的相關(guān)性，所用軟件為SPSS 17.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水平生物炭與干旱脅迫對接種紫花苜蓿光合特性的影響

2.1.1紫花苜蓿葉面積的變化 葉面積是一個與產(chǎn)量和干物質(zhì)生產(chǎn)生理過程有關(guān)的重要組成成分，同時又是比較容易控制的一個因素，更是測定植株光合能力的最好指標(biāo)。如圖1所示，干旱脅迫和生物炭施用對紫花苜蓿葉面積有顯著影響(P<0.05)，二者之間交互作用未達(dá)到顯著水平；生物炭水平相同時，苜蓿葉面積隨干旱程度的增加顯著降低(P<0.05)，與W0相比，W3干旱脅迫后植株葉面積降低最顯著(P<0.05)，下降幅度分別為76.11%，72.82%，81.60%，82.35%和78.33%。W0與W2處理下，與不添加生物炭的植株相比，1%或1.5%水平的生物炭能夠顯著增加植株葉面積(P<0.05)；W1與W3干旱脅迫時，添加水平為2%的生物炭后植株葉面積較不添加生物炭植株分別增加了21.64%和16.11%。由此說明，干旱脅迫下添加生物炭有利于葉片生長發(fā)育，水平為1%的生物炭促進(jìn)效果最顯著，其次為1.5%的生物炭。

圖1 生物炭對干旱脅迫下接種紫花苜蓿葉面積的影響Fig.1 Effect of biochar on leaf area of Alfalfa inoculated with rhizobia under different drought stress注：小寫字母表示各指標(biāo)在相同水分處理下不同生物炭水平之間差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示同一生物炭水平下不同水分處理各指標(biāo)之間差異顯著(P<0.05)。W0代表正常供水;W1代表輕度干旱脅迫;W2代表中度干旱脅迫;W3代表重度干旱脅迫。*顯著相關(guān)(P< 0.05)，下同Note:Lowercase letters indicate significant differences in 5% levels between different biochar levels under the same water treatment,capital letters indicate significant differences in 5% levels between different water treatment indexes under the same biochar level. W0 for normal water supply;W1 for mild drought stress;W2 for moderate drought stress,W3 for severe drought stress;* means significant correlation at the 0.05 level,the same as below

2.1.2紫花苜蓿葉綠素含量的變化 葉綠素含量是反映植物葉片光合能力及植株健康狀態(tài)的重要指標(biāo)。由圖2可知，生物炭添加和干旱脅迫對紫花苜蓿葉綠素含量有顯著影響，二者之間交互作用顯著(P<0.05)；W0，W1和W3時添加生物炭對植株葉綠素含量的影響未達(dá)到顯著水平，而W2干旱脅迫時添加生物炭后植株葉綠素含量顯著提升(P<0.05)；不添加生物炭時，W2干旱脅迫處理后植株葉綠素含量顯著低于W0與W1(P<0.05)；生物炭水平為0.5%時，W1與W2干旱脅迫后葉綠素含量上升了10.11%和11.23%；生物炭水平為2%時，W0，W1和W2處理后葉綠素含量顯著高于W3(P<0.05)。

圖2 生物炭對干旱脅迫下接種紫花苜蓿葉綠素濃度的影響Fig.2 Effect of biochar on Chlorophyll concentration of Alfalfa inoculated with rhizobia under different drought stress

2.1.3紫花苜蓿光合效率的變化 光合作用是植物生長和物質(zhì)積累的基礎(chǔ)，對植物生長發(fā)育具有重要意義。如圖3A所示，W1，W2和W3干旱脅迫時添加生物炭和干旱脅迫對Pn有顯著影響，二者交互作用顯著(P<0.05)，W1，W2，W3干旱脅迫時Pn隨生物炭濃度的升高先增加后降低；生物炭水平相同時，與W0相比，W3干旱脅迫時Pn有所下降，下降幅度分別為53.87%，38.22%，26.84%，41.13%和58.70%。在干旱脅迫下施用不同水平生物炭對紫花苜蓿光合效率起到了一定的緩解作用，且隨添加水平的升高，緩解作用呈先增加后降低的變化。W1干旱脅迫時，與不添加生物炭相比，施加0.5%和1%的生物炭后Pn顯著升高(P<0.05)，分別提高了15.71%和22.54%。W2干旱脅迫時，添加1%水平的生物炭后Pn提高了25.98%。W3干旱脅迫時，添加0.5%，1%和1.5%水平的生物炭后Pn顯著高于不添加生物炭的植株(P<0.05)。

由圖3B可知，生物炭和干旱脅迫顯著影響植株Gs，二者之間存在互作效應(yīng)(P<0.05)。W1，W2和W3干旱脅迫時添加生物炭后Gs隨生物炭濃度的增加先上升后降低。W2和W3干旱脅迫時Gs相較W0均有不同程度降低。W1干旱脅迫時施加0.5%，1%或1.5%的生物炭對Gs的緩解作用達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。W2與W3干旱脅迫時添加1%水平的生物炭后Gs有所上升，分別較不添加生物炭的植株增加了36.62%和35.52%。

如圖3C所示，W1和W2處理時，干旱脅迫和生物炭添加對植株Ci互作效應(yīng)顯著(P<0.05)，隨生物炭濃度的上升Ci先增加后降低。各生物炭水平下，W3干旱脅迫時Ci降低最明顯，分別降低了31.72%，25.99%，17.8%，12.20%和23.85%。W1和W2干旱脅迫時添加1%水平的生物炭后Ci顯著高于生物炭添加量為2%的植株(P<0.05)。

如圖3D所示，W0處理時添加生物炭對植株蒸騰速率的影響未達(dá)到顯著水平，W1，W2和W3處理時干旱脅迫和生物炭對蒸騰作用有顯著互作效應(yīng)(P<0.05)。與干旱處理時添加不同水平生物炭對植株P(guān)n，Ci和Gs三個指標(biāo)的影響相同，生物炭添加對Tr起到了一定的促進(jìn)作用，但是W3干旱脅迫后植株Tr依舊顯著低于其他水分處理(P<0.05)。W1，W2和W3干旱脅迫時添加1%的生物炭后Tr顯著高于未添加生物炭的植株(P<0.05)。

2.2 不同水平生物炭與干旱脅迫對接種紫花苜蓿生物量的影響

由表2可知，生物炭和干旱脅迫顯著影響植株地上干重，二者之間互作效應(yīng)顯著(P<0.05)。隨著干旱程度的增加，紫花苜蓿地上干重顯著降低(P<0.05)。W0處理時，地上干重隨生物炭水平的升高而增加，生物炭水平為2%時植株地上生物量是不添加生物炭植株的1.6倍；W1與W2干旱脅迫時，紫花苜蓿地上干重隨生物炭水平的增加呈先升高后降低的趨勢，W1干旱脅迫時最適生物炭水平為0.5%或1%，地上干重分別提升了24.80%和15.86%。W2干旱脅迫時添加2%的生物炭后地上干重較不添加生物炭的植株相比降低了34.52%。W3干旱脅迫時，添加不同水平生物炭對紫花苜蓿地上干重影響不大。由此可見，干旱脅迫下，高水平生物炭對植株地上生物量產(chǎn)生了抑制作用。

生物炭和水分處理顯著影響植株地下干重，二者之間互作效應(yīng)顯著(P<0.05)。不添加生物炭時，與W0相比，W1與W2干旱脅迫能夠提升植株地下干重，提升幅度分別為37.65%和53.26%。除W1干旱脅迫時添加0.5%水平的生物炭后紫花苜蓿地下干重顯著升高外(P<0.05)，其他干旱脅迫對地下干重影響不顯著。添加2%的生物炭后，各干旱脅迫下植株地下干重均降低。

圖3 生物炭對干旱脅迫下接種紫花苜蓿光合效率的影響Fig.3 Effect of biochar on photosynthetic of Alfalfa inoculated with rhizobia under different drought stress

2.3 接種紫花苜蓿光合特性與生物量之間的相關(guān)性

由表3可知,各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，植株葉面積與光合效率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。植株P(guān)n，Ci，Gs，Tr與產(chǎn)量極顯著相關(guān)(P<0.01)，是引起植株地上生物量變化的主要因素，但光合效率與地下生物量無顯著相關(guān)關(guān)系。

表2 生物炭與干旱脅迫對接種紫花苜蓿生物量的影響Table 2 Effects of biochar and drought stress on biomass of inoculated alfalfa

表3 紫花苜蓿光合特性與生物量之間的相關(guān)性Table 3 Correlation between photosynthetic characteristics and biomass of alfalfa

3 討論與結(jié)論

植物的葉片不僅是對生長環(huán)境變化敏感、變異性和可塑性較大的組織器官，同時也是光合和呼吸等生理代謝活動的功能器官[30]。本研究結(jié)果表明，紫花苜蓿葉面積和光合特性均受到了水分脅迫的影響，添加生物炭對干旱脅迫起到了一定的緩解作用，這與Zoghi[31]的研究結(jié)果一致。生物炭添加不僅能使植株葉面積增大用以捕獲光能，還能提高凈光合速率，促進(jìn)植物光能利用效率[32]。同一干旱脅迫下，隨著生物炭水平的升高，紫花苜蓿葉面積先增加后降低，表明適量生物炭(1%或1.5%)對其有良好的促進(jìn)作用。Pn，Gs，Ci和Tr是表征植物葉片光合作用的重要指標(biāo)，其大小可直接反映該植物的光合能力，進(jìn)而決定植物生長發(fā)育和生產(chǎn)力[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下添加生物炭后紫花苜蓿葉片光合效率指標(biāo)均出現(xiàn)“低促高抑”的現(xiàn)象，輕度與中度干旱脅迫添加0.5%或1%的生物炭后Pn顯著高于其他添加水平的植株，表明干旱條件下適量生物炭添加對植株光合作用起到了促進(jìn)效果。重度干旱脅迫時添加2%水平的生物炭后紫花苜蓿葉綠素含量降低，重度干旱阻礙植株的水分供應(yīng)，減緩植株生理代謝過程，抑制葉綠素合成[34]。光合參數(shù)在不同施炭量下變化不一樣，可能是施炭量不同會影響土壤養(yǎng)分組成和理化性質(zhì)，進(jìn)而影響苜蓿根系對養(yǎng)分的吸收和地上部的光合作用[35]。

生物量能夠直接反映植物的生長狀況，生物量與地上部分光合能力密切相關(guān)。前人研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重水分脅迫會抑制植物PSⅡ光化學(xué)活性，從而影響紫花苜蓿干草產(chǎn)量[36]。土壤含水量對植物光合作用影響很大，水分虧缺時，氣孔阻力增加，CO2進(jìn)入受阻，光合效率降低[37-38]。生物炭對緩解植物逆境脅迫方面有重要作用，施用生物炭能提高植物葉片的光合參數(shù)，增強葉片光合積累能力[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加生物炭不僅有助于提高葉片光合效率，也能增加植株葉綠素含量，促進(jìn)干物質(zhì)積累，為后期產(chǎn)量形成奠定基礎(chǔ)。這是因為適量生物炭施用可有效提高紫花苜蓿葉片光能利用率，調(diào)控植物對養(yǎng)分的吸收與運轉(zhuǎn)，保障地上部光合產(chǎn)物的形成、積累與轉(zhuǎn)化。一般認(rèn)為，生物炭對植物生長和產(chǎn)品質(zhì)量的影響也與生物炭施用量等諸多因素有關(guān)。Asai等[40]研究發(fā)現(xiàn)，水稻產(chǎn)量隨生物炭用量的增加而增加，但當(dāng)生物炭施用量達(dá)16 t·hm-2時，其產(chǎn)量不再增加。本試驗結(jié)果與其不同，本試驗中無水分脅迫時添加2%水平的生物炭后地上生物量較不添加生物炭的植株增加1.6倍，這可能是因為正常水分處理下生物炭添加給根瘤菌提供了良好的生存環(huán)境，促進(jìn)苜蓿對土壤氮素的吸收與利用，提高苜蓿干物質(zhì)的積累[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫時添加2%的生物炭后紫花苜蓿地上與地下生物量較不添加生物炭的植株相比均降低，這與李明陽等[42]的研究結(jié)果一致，可能是因為高濃度生物炭會提高土壤碳氮比，降低土壤中有效氮含量，不利于植物吸收養(yǎng)分。本試驗表明，適量生物炭添加能改善干旱脅迫下接種紫花苜蓿的生長和光合特性，這與李東庭等[43]對基質(zhì)添加生物炭對辣椒育苗效果的影響結(jié)果一致。植株葉綠素含量，Pn，Ci，Gs和Tr均隨生物炭添加量的增加而提高，且在輕度與中度干旱脅迫時添加0.5%或1%的條件下效果最佳。這一方面是因為生物炭保水、保肥特性能夠提高苜蓿對水分和養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而提高光合效率、促進(jìn)生長。另一方面可能是因為生物炭添加給根瘤菌提供了良好的生存環(huán)境，減緩植物受到干旱脅迫的程度，間接提高紫花苜蓿的光合作用速率和干物質(zhì)積累速率[44]。

綜上所述，在基于接種根瘤菌條件下適量生物炭添加可明顯緩解干旱脅迫對紫花苜蓿葉片光合作用的抑制，促進(jìn)紫花苜蓿生長。過量施用生物炭會降低植物光合效率，抑制植物正常生長?？傮w而言，干旱處理后中等生物炭用量(0.5%～1%)能夠提高紫花苜蓿生物量，但本研究只是短期研究，生物炭添加對干旱脅迫下植被生長的作用機(jī)制尚且未知，還需通過田間試驗深入探究。