28個(gè)中國(guó)紫蘇屬種質(zhì)資源的染色體核型分析

孫浩男， 田 琳， 溫春秀， 劉冬云， 王 鑫， 李明陽

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 河北 保定 071000;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所， 河北 石家莊 050000)

唇形科(Lamiaceae)紫蘇屬(PerillaLinn.)植物為一年生草本植物，主要原產(chǎn)于亞洲亞熱帶地區(qū)，世界各國(guó)均有引種栽培，我國(guó)的中南部和東南部是其野生資源的主要集中地區(qū)[1-3]。紫蘇屬植物集食用、藥用、油用、觀賞等一體，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其在中國(guó)的栽種歷史悠久，早在2000多年前，就有文獻(xiàn)記載古人食用栽培紫蘇[4-8]。截至今日，POWO(Plants of the world online)登錄的紫蘇屬現(xiàn)有1個(gè)種3個(gè)變種：紫蘇原變種(P.frutescensvar.frutescens)、野生紫蘇(P.frutescensvar.acuta)、回回蘇(P.frutescensvar.crispa)和微毛紫蘇(P.frutescensvar.hirtella)。但長(zhǎng)期以來，紫蘇屬植物的分類問題仍飽受爭(zhēng)議，如耳齒紫蘇和白蘇是否該單獨(dú)劃分為變種，各學(xué)者通過形態(tài)學(xué)[8]、同工酶技術(shù)[9]等方面的研究，所持觀點(diǎn)不一，如今在我國(guó)《中國(guó)植物志》[1]中，仍將耳齒紫蘇(P.frutescensvar.auriculato-dentata)列為單獨(dú)的一個(gè)種。

染色體是遺傳信息的主要載體，而染色體分析是細(xì)胞學(xué)標(biāo)記中常用的研究方法[10]。對(duì)染色體數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)也可用來確定材料是否為多倍體[11]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)紫蘇屬植物染色體形態(tài)和核型參數(shù)方面的研究已有報(bào)道。Akik等[12]曾對(duì)日本野生紫蘇、紫蘇原變種的染色體數(shù)目進(jìn)行了鑒定，惠榮奎[13]、張旭[14]等也均有對(duì)我國(guó)部分紫蘇屬植物的染色體數(shù)目及核型進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和測(cè)量。通過比較分析，不同地產(chǎn)的紫蘇資源在核型上具有不同程度的差異。因此，本文采用常規(guī)壓片法，對(duì)收集自我國(guó)多個(gè)地區(qū)的6個(gè)類型共28份材料的紫蘇屬植物進(jìn)行核型分析，旨在為紫蘇屬植物資源的分類、鑒定及利用提供更多的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為產(chǎn)自我國(guó)的28份紫蘇屬植物材料的種子，進(jìn)行萌發(fā)處理后取得根尖部位組織，名稱詳見表1，均由河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

1.2 方法

將種子提前使用60℃溫水水浴30 min，再用200 mg·L-1赤霉素浸種進(jìn)行8 h催芽，最后放在干凈的培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)種子發(fā)芽根長(zhǎng)1～2 cm后，對(duì)幼嫩的根尖部位進(jìn)行處理，處理方法參考周楊等[15]和孫桂芳等[16]的方法并進(jìn)行改進(jìn)：用冰水混合物預(yù)處理根尖部位24 h；轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液中固定20～24 h(若固定后的材料不能立即使用，可暫時(shí)轉(zhuǎn)入70%酒精中，保存不超過1周)；將固定或保存好的材料使用蒸餾水沖洗3～4次；用1 mol·L-1的稀鹽酸60℃水浴10 min；再次沖洗3～4次后，放入蒸餾水中低滲10～30 min；切取根尖先端1～2 mm放置于載玻片上，用吸水紙吸去根尖表面多余水分，并用改良卡寶品紅染色30 min；擦拭多余染液及污漬，用鑷尖輕搗根尖后，蓋上蓋玻片進(jìn)行壓片。

將制好的壓片放在Leica DM 4000顯微鏡下觀察，選取并拍攝有絲分裂中期且染色體分散良好的細(xì)胞進(jìn)行拍攝，核型數(shù)據(jù)測(cè)量方法和處理方式等參考霍辰思等[17]，染色體計(jì)數(shù)和核型分析參考李懋學(xué)等[18-19]的方法，染色體類型按照Levan[20]的標(biāo)準(zhǔn)，核型類型分析參照Stebbins[21]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，核型不對(duì)稱系數(shù)按照Arano[22]的方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目與倍性

由表2可知，28份材料的染色體數(shù)目穩(wěn)定，染色體倍性有兩種，其中3個(gè)多倍體紫蘇為四倍體，2n=4x=80，其余25份材料均為二倍體，2n=2x=40。

表1 供試紫蘇材料的基本信息Table 1 The information of the tested Perilla

續(xù)表1

2.2 染色體核型分析

28份紫蘇屬植物材料的主要核型參數(shù)見表2和圖2。結(jié)果表明，紫蘇屬植物的染色體組成類型主要為m和sm類型兩種，其中11個(gè)(YS-YL，ZS-AG，ZS-PY，ZS-CD，ZS-SXQ，ZS-ZY，BS-LZ，BS-WL3，BS-WL4，EC-WX，EC-WSZ)全部由m和sm類型的染色體組成，而其余17個(gè)材料由m，sm和st 3種類型組成，其st類型染色體數(shù)量為2～12條不等。在28個(gè)材料中，除EC-WSB有2對(duì)染色體帶有隨體，其他僅有1對(duì)帶有隨體，皆位于染色體短臂上，隨體的相對(duì)長(zhǎng)度介于0.91%～2.84%之間。

28份紫蘇屬植物材料的核型類型較為豐富，有2A，3A，2B，3B 4個(gè)類型，15個(gè)(YS-YL，HH-GX，ZS-BL,ZS-AG，ZS-CD，ZS-HNH，ZS-SXQ，ZS-CZ1，ZS-QYB，BS-GS，BS-LZ，WL4，EC-WX，EC-WSB，EC-WSZ)為2A型，5個(gè)(ZS-BZ，ZS-PY，ZS-QYQ，WL2，EC-TB)為3A型,4個(gè)(ZS-TS，BS-YS，WL3，EC-EC)為2B型，4個(gè)(ZS-ZY，DZ-1，DZ-2，DZ-3)為3B型。28個(gè)材料的最長(zhǎng)染色體/最短染色體值的范圍為1.50～2.80，臂比大于2的染色體占染色體總數(shù)的百分比為10%～65%，核型不對(duì)稱系數(shù)介于59.69%～68.52%之間。平均不對(duì)稱系數(shù)由大到小排列為：多倍體紫蘇(67.85%),回回蘇(66.10%),紫蘇(64.99%),白蘇(64.30%),耳齒紫蘇(63.61%),野生紫蘇(62.05%)。

表2 供試紫蘇材料的核型Table 2 Karyotype of the tested Perilla

圖1 供試紫蘇材料的有絲分裂中期染色體Fig.1 Mitotic chromosomes at metaphase of the tested Perilla

2.3 染色體進(jìn)化趨勢(shì)分析

采用核型參數(shù)中的平均臂比和核型不對(duì)稱系數(shù)繪制核型散點(diǎn)圖[11,23]，圖中越靠近右上角表明進(jìn)化程度越高，反之則越低。由圖2可知，28個(gè)材料中，DZ-2和DZ-3較為進(jìn)化，ZS-SXQ和BS-LZ較為原始。

圖2 供試紫蘇材料的核型散點(diǎn)圖Fig.2 Karyotype coordinate image of the tested Perilla

2.4 聚類分析

根據(jù)秦丹等的方法[24]繪制聚類分析圖(圖3)。在遺傳距離為4.0時(shí)，28個(gè)紫蘇被劃為3大類，其中回回蘇、多倍體紫蘇全部歸為第一大類，而其二大類包含野生紫蘇和部分紫蘇原變種(包含白蘇和回回蘇)，第三大類僅包含2個(gè)紫蘇材料。相比較而言，ZS-SXQ和BS-LZ兩者與其他26個(gè)紫蘇的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

染色體數(shù)目是物種的重要特征之一[25]。本試驗(yàn)采用常規(guī)壓片法，從細(xì)胞學(xué)標(biāo)記方面對(duì)28個(gè)中國(guó)紫蘇屬植物的染色體核型進(jìn)行了檢測(cè)結(jié)果表明，其數(shù)目穩(wěn)定，存在二倍體和四倍體，染色體基數(shù)均為x=20，其中未發(fā)現(xiàn)B染色體，野生紫蘇、回回蘇、紫蘇原變種(包括白蘇和耳齒紫蘇)類型均為二倍體(2n=40)、多倍體紫蘇均為四倍體(2n=80)。這與惠榮奎[13]、張旭等[14]對(duì)中國(guó)紫蘇屬植物染色體數(shù)目的報(bào)道結(jié)果一致，但與Akik等[12]報(bào)道的日本紫蘇屬植物不同(野生紫蘇2n=2x=20)。從染色體倍性上看，紫蘇屬植物多為二倍體，而四倍體較少，但同為唇形科的薄荷屬(MenthaLinn.)不僅普遍存在染色體多倍化現(xiàn)象，也常見非整倍體[26]。在前人對(duì)鼠尾草屬(SalviaLinn.)的研究中發(fā)現(xiàn)，原產(chǎn)自國(guó)內(nèi)外的鼠尾草染色體基數(shù)存在明顯的區(qū)別[10,27]，目前所報(bào)道的紫蘇屬染色體基數(shù)存在10和20兩種[12-14]，而本次供試的28個(gè)材料中僅發(fā)現(xiàn)一種染色體基數(shù)，推測(cè)與材料的生境地和來源有關(guān)。紫蘇屬植物的染色體類型共包含3種類型(m，sm，st)，以s和sm類型為主，28個(gè)紫蘇屬植物的核型公式不同，隨體的數(shù)目、大小及所處位置也存在差別，在前人對(duì)野生山丹(Liliumpumilum)[28]、波斯菊(Cosmosbipinnata)[16]的核型研究中也發(fā)現(xiàn)了相同的現(xiàn)象。但耿帆[29]認(rèn)為這些差異也可能是由于預(yù)處理?xiàng)l件、染色體縮短程度、觀察和測(cè)量方法不同。

28個(gè)材料的核型類型十分豐富，出現(xiàn)了2A，3A，2B，3B 4種，不同類型的紫蘇屬植物在核型類型上存在一定差異：野生紫蘇和回回蘇為2A型，多倍體紫蘇為3B型，紫蘇原變種下的核型類型最為豐富，其中紫蘇、白蘇和耳齒紫蘇的皆含有2A，3A，2B型，在紫蘇中還額外發(fā)現(xiàn)了3B型。在張旭[14]對(duì)我國(guó)4種紫蘇屬植物的染色體核型研究中，共發(fā)現(xiàn)了2A，3A，3B 3種類型，而惠榮奎[13]僅發(fā)現(xiàn)了2A，2B兩種，本次試驗(yàn)的材料與兩者的取材存在一定差異，推測(cè)這可能和紫蘇屬植物在我國(guó)的分布范圍較廣有關(guān)。張海洋[30]發(fā)現(xiàn)，栽培種芝麻(Sesamumindicum)的不對(duì)稱系數(shù)要明顯高于野生種芝麻，通過核型散點(diǎn)圖和聚類分析圖發(fā)現(xiàn)，28個(gè)紫蘇并不能明顯的進(jìn)行分類，很可能是由于各地對(duì)于紫蘇屬植物引種栽培程度不一導(dǎo)致，因此，僅依靠核型參數(shù)對(duì)紫蘇屬植物進(jìn)行分類較為困難。根據(jù)洪德元[31]和Stebbins[21]的觀點(diǎn)，植物染色體倍性進(jìn)化的趨勢(shì)是由低到高，核型不對(duì)稱系數(shù)較大的類群較為進(jìn)化，相反則較為原始。各類型紫蘇的平均不對(duì)稱系數(shù)上，多倍體紫蘇>回回蘇>紫蘇>白蘇>耳齒紫蘇>野生紫蘇，因此推測(cè)紫蘇屬內(nèi)多倍體紫蘇和回回蘇的進(jìn)化程度較高，而野生紫蘇較為原始，這與張旭等[14]、惠榮奎[13]研究結(jié)果不一致，推測(cè)與材料來源不同有關(guān)。和目前國(guó)內(nèi)所報(bào)道的一些唇形科植物相比，紫蘇屬的染色體不對(duì)稱系數(shù)略高于獨(dú)一味屬(LamiophlomisKudo)、糙蘇屬(PhlomisLinn.)[32]，低于薰衣草屬(LavandulaLinn.)[33]，與部分荊芥屬(NepetaLinn.)[34]較為接近。因此，推測(cè)紫蘇屬在唇形科內(nèi)的進(jìn)化地位較為原始。

圖3 供試紫蘇材料核型聚類圖Fig.3 Cluster image of the tested Perilla based on karyotype

核型試驗(yàn)中，成功與否最關(guān)鍵的步驟便是材料的預(yù)處理，對(duì)根尖進(jìn)行染色體壓片前，多用到物理方法和化學(xué)方法來進(jìn)行預(yù)處理，其中化學(xué)方法用到的藥劑多具毒性，如對(duì)二氯苯、秋水仙素、8-羥基喹啉等[19,35]。本試驗(yàn)采用冰水混合物對(duì)紫蘇幼嫩的根尖進(jìn)行預(yù)處理24 h，與前人所采用的試驗(yàn)方法相比，處理時(shí)較為安全，更容易把握處理時(shí)間，同樣能夠獲得處于中期分裂相的細(xì)胞。低滲處理能夠增強(qiáng)染色體的分散程度[36]，由于多倍體紫蘇的染色體數(shù)量較多，壓片時(shí)染色體極易交疊，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行低滲處理的根尖更便于觀察其細(xì)胞內(nèi)的染色體形態(tài)和數(shù)量。

總體來看，紫蘇屬植物具有豐富的的染色體遺傳多樣性。目前，我國(guó)所報(bào)道紫蘇屬植物的染色體核型參數(shù)仍極為有限。而本次試驗(yàn)得到的大多核型公式均為紫蘇屬內(nèi)首次報(bào)道，且對(duì)鮮有研究的多倍體紫蘇的核型參數(shù)進(jìn)行了補(bǔ)充，這些數(shù)據(jù)均為我國(guó)紫蘇屬植物的分類、鑒定等提供了大量理論參考。但本次采集的材料有限，尤其是回回蘇和野生紫蘇類型的樣本極少，還存在很大的局限性，若要在細(xì)胞學(xué)標(biāo)記方面判斷紫蘇屬植物的分類及進(jìn)化則需要更深層次的研究。