基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的三仙湯治療骨質(zhì)疏松癥作用機制研究

戴夢竹 任路 何信用 王群 徐寧陽 陳文娜

1.遼寧中醫(yī)藥大學研究生學院，遼寧 沈陽 110847

2.遼寧中醫(yī)藥大學醫(yī)學檢驗學院，遼寧 沈陽 110847

骨質(zhì)疏松癥 (osteoporosis, OP) 是一種以骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，骨量減少導致骨骼脆性增加易發(fā)生骨折的常見骨病[1]，已成為嚴重影響人群生活質(zhì)量的公共健康問題。根據(jù)我國2013年人口普查結(jié)果推測，至2050年60以上的老人約4億，中國骨質(zhì)疏松癥的患者將達到2.12億之多[2]。目前臨床通常采用西藥治療，如骨形成促進劑、骨吸收抑制劑、及其他機制類藥物[3]。近年研究表明運用中醫(yī)中藥治療骨質(zhì)疏松的效果顯著, 因其價格價廉、不良反應(yīng)小、整體調(diào)節(jié)、標本兼治彰顯了獨特的優(yōu)勢[4]，越來越被大眾所認可。三仙湯出自國醫(yī)圣手干祖望，俗稱“中藥小激素”，是由淫羊藿(仙靈脾)、仙茅、仙鶴草三味藥組成。因藥味數(shù)少，價格低廉效果好，臨床上經(jīng)常使用。姜良鐸教授用三仙湯治療骨質(zhì)疏松等疾病療效顯著。秦臘梅[5]證實三仙湯對去卵巢大鼠骨生物力學性能有改善的作用，可用于治療骨質(zhì)疏松?，F(xiàn)代藥理實驗表明，三仙湯通過提高血鈣、血磷、血清堿性磷酸酶水平，減少尿鈣、尿磷含量的機制，促進成骨細胞的增殖[6-7]。但其有效成分和分子機制等尚不明確。傳統(tǒng)中醫(yī)藥文化博大精深卻一直很難被世界所認可，其多成分-多靶點-多通路作用的復(fù)雜性導致了中醫(yī)藥在國際化的發(fā)展進程中步履艱難[8]。近年來隨著中醫(yī)藥研究的不斷深入，生物信息學的蓬勃發(fā)展也給中醫(yī)藥的機制研究帶來了新的方向?；诖?，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，揭示三仙湯干預(yù)OP的分子作用機制，為其臨床應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 仙湯中有效成分及靶點獲得

通過使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)[9]檢索三仙湯中淫羊藿(仙靈脾)、仙茅、仙鶴草三味中藥的化學成分。在此結(jié)果上根據(jù)篩選條件化合物類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18，口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30 %篩選藥物的有效活性成分及相應(yīng)的成分靶點[10]。同時通過Uniprot數(shù)據(jù)庫，將已篩選出的藥物成分靶點名稱進行標準化命名，建立藥物活性成分靶點數(shù)據(jù)集。

1.2 骨質(zhì)疏松癥(OP)相關(guān)靶點獲得

在兩大常用數(shù)據(jù)庫Genecards(https://www.genecards.org/)[11]和OMIM(https://omim.org/)[12]中輸入檢索詞：osteoporosis，將上述預(yù)測靶基因合并作為疾病相關(guān)靶標數(shù)據(jù)集。

1.3 藥物-疾病的交集靶點及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/網(wǎng)站將藥物和疾病靶基因取交集，采用Cytoscape 3.7.1繪制藥物、疾病、靶基因網(wǎng)絡(luò)圖。再將篩選到的交集基因提交至String網(wǎng)站(https://string-db.org/)[13]，minimum required interaction score為medium confidence: 0.400生成PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖。利用perl語言，提取關(guān)鍵基因連接度蛋白統(tǒng)計條圖(排名前30)，生成所有節(jié)點連接度統(tǒng)計結(jié)果文件。PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖是從生物化學、信號轉(zhuǎn)導等角度研究疾病相關(guān)蛋白質(zhì)分子之間的關(guān)聯(lián)性[14]。將化合物-藥物靶點網(wǎng)絡(luò)圖導入Cytoscape進行Degree值分析，將篩選出的核心基因與PPI網(wǎng)絡(luò)圖得出的結(jié)果進行比對，得到可信度較高的核心基因。應(yīng)用R 3.6.0軟件，安裝RSQLite包及org.Hs.eg.db包，將藥物-疾病交集基因名稱轉(zhuǎn)換為基因ID，為GO分析和KEGG分析做準備。

1.4 GO生物學過程富集分析和KEGG代謝通路富集分析

利用R 3.6.0軟件，安裝colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview、ggplot2等程集包進行GO(gene ontology)及KEGG(KEGG pathway analysis)富集分析，以P<0.01 且從小到大排序作為條件，篩選出前20條最具有統(tǒng)計學意義的條圖、氣泡圖以及關(guān)鍵信號通路圖，并將其結(jié)果進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 三仙湯活性化合物的篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺分析篩選出活性化合物共35個，見表1。

表1 三仙湯活性化合物信息

2.2 OP與三仙湯的交集分析

通過Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫，用疾病名稱“osteoporosis”進行檢索，去除重復(fù)后可得到 3 490 個與OP 相關(guān)的靶點。通過數(shù)據(jù)庫我們得到三仙湯有197個作用靶點。將 3 490個疾病靶點與 197 個藥物成分靶點輸入Draw Venny Diagram在線程序軟件繪制韋恩圖，取其交集后獲得疾病-藥物共同靶點 127 個，見圖 1。

圖1 疾病靶點-藥物靶點韋恩圖

2.3 化合物成分-藥物靶點網(wǎng)絡(luò)圖

在化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中包括155個節(jié)點，其中28個是化合物節(jié)點，詳見表2。127個藥物疾病交集靶點節(jié)點，紫色三角形節(jié)點代表化合物節(jié)點，綠色圓形代表藥物靶點節(jié)點，連線代表著化合物與靶點之間具備相互作用關(guān)系，見圖2。

表2 化合物節(jié)點

圖2 三仙湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 三仙湯與OP蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建

將上述藥物與疾病交叉共有的127個靶蛋白交集上傳至STRING數(shù)據(jù)庫平臺進行分析，得到了PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖 3。共有127個節(jié)點，2 225條邊，平均節(jié)點度為35。圖中線條代表蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，連接靶點之間線條的數(shù)量與該靶點作為潛在靶點的可能性呈正相關(guān)。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)的連線結(jié)果通過柱狀圖可視化，見圖4，可以得出蛋白激酶(AKT1)、白介素6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)等基因與其他基因聯(lián)系最為密切，為PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。對化合物-藥物靶點網(wǎng)絡(luò)進行Network Analyze分析，Degree值越大表示該節(jié)點之間相連的數(shù)目越多，越可能成為核心靶點。將篩選出Degree值大于5的基因與PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因一同輸入Draw Venny Diagram軟件繪制韋恩圖，見圖5。結(jié)果得到20個交集核心基因：AKT1、IL-6、VEGFA、JUN、PPARG、IL10、MAPK1、MAPK14、MMP2、RELA、HMOX1、PTGS2、EGFR、ICAM1、BCL2L1、CASP3、CCND1、MMP9、ESR1、ERBB2。

圖3 三仙湯靶點 PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 每個基因鏈接節(jié)點數(shù)

圖5 化合物-藥物核心靶點與PPI核心靶點韋恩圖

2.5 靶點GO 生物過程和 KEGG 通路富集分析

為進一步分析三仙湯作用于骨質(zhì)疏松癥的127個交集靶點的機制，進行了GO、KEGG富集分析，得到其基因的功能以及主要的信號通路。分析得到132個生物學過程。結(jié)果顯示(根據(jù)P值升序選取排名前20位)，潛在關(guān)鍵靶基因涉及核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性等。見圖6，表3。猜測這些功能可能是三仙湯治療OP 的重要生物過程。此外，KEGG富集得到150條信號通路。結(jié)果顯示(根據(jù)P值大小選取排名前20位)，涉及AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、IL-17信號通路等，猜測這些可能是三仙湯治療OP最重要的信號通路。見圖7，表4。

表3 GO生物學過程富集結(jié)果

表4 KEGG信號通路富集結(jié)果

圖6 GO 生物學過程分析

圖7 KEGG 信號通路富集分析

3 討論

三仙湯由淫羊藿(仙靈脾)、仙茅、仙鶴草組成。以上3味藥聯(lián)合使用，可以補虛扶正、安神益氣?，F(xiàn)代研究指出，三仙湯具有激素或者類激素的作用，可調(diào)控內(nèi)分泌系統(tǒng)以及卵巢、雌性激素的感受器受體[15]。在骨質(zhì)疏松的調(diào)節(jié)方面，集中表現(xiàn)在加強成骨細胞的活性以及控制破骨細胞的骨代謝能力，提高去卵巢大鼠血鈣、血磷、血清ALP水平，降低尿鈣、尿磷濃度等[16]。淫羊藿具有抗腫瘤、抗炎、免疫抑制、抗氧化等作用[17-18]，可以刺激成骨細胞的活性, 抑制破骨細胞產(chǎn)生[19]。仙茅提取物能夠提高血清骨鈣素的水平，降低脫氧吡啶啉的含量[20]。仙鶴草可提高抗炎因子表達[21]。

為系統(tǒng)地研究三仙湯治療骨質(zhì)疏松癥的確切靶點，本文采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，篩出28個三仙湯的主要活性成分以及127個治療靶點。治療OP的核心靶標主要有AKT1、IL-6、VEGF、JUN等，這些靶點通過分子、細胞、生物過程層面作用于OP，主要影響核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、細胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、血紅素結(jié)合等生物學功能。已有文獻報導，激活后的AKT可以通過RANK/RANKL信號調(diào)控破骨細胞的分化[22]。白介素6為體內(nèi)重要的炎癥因子，周游等[23]發(fā)現(xiàn)白IL-6的升高會促進破骨細胞的分泌, 抑制骨生成，被認為是調(diào)節(jié)骨吸收的重要細胞因子。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是最活躍的促血管生成因子，能促進血管內(nèi)皮細胞的分裂，李建民等[24]發(fā)現(xiàn)VEGF減少，血管內(nèi)皮易損傷，微循環(huán)發(fā)生障礙就會影響骨質(zhì)代謝，骨形成降低，產(chǎn)生OP。JUN為JAK/STAT信號通路中重要基因，可被外界刺激快速激活，提高JUN的表達可以促進成骨細胞增殖分化，改善OP[25]。KEGG結(jié)果發(fā)現(xiàn)了150條信號通路，主要包括AGE-RAGE信號通路、動脈粥樣硬化信號通路、IL-17信號通路、前列腺癌通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路等。研究發(fā)現(xiàn)改變AGEs/RAGE/Nox4/NF-κB信號通路中相關(guān)蛋白的含量，可以減輕氧化應(yīng)激損傷，防治骨質(zhì)疏松[26]。流行病學表示，動脈粥樣硬化與OP具有一定的關(guān)聯(lián)性，IL-6、TNF等促炎因子會促使血管發(fā)生動脈粥樣硬化，導致供血不足，骨形成減少[27]。張國權(quán)等[28]發(fā)現(xiàn)，IL-17可促進合成TNF-α, 并且上調(diào)IL-6、RANKL、M-CSF等的表達，促進破骨細胞的分化發(fā)育，增強骨組織炎性反應(yīng)。相關(guān)文獻表明前列腺癌信號通路[29]、TNF信號通路[30]等也會影響到骨質(zhì)代謝。通過分析三仙湯主要通過影響細胞分化、凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種復(fù)雜的生物學過程發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。這與現(xiàn)有的相關(guān)研究結(jié)果基本相同，體現(xiàn)了本研究預(yù)測結(jié)果具有可信度。同時也體現(xiàn)了體內(nèi)代謝是互相關(guān)聯(lián)，相互協(xié)同的，對于骨質(zhì)疏松癥的醫(yī)治應(yīng)該考慮與其他系統(tǒng)的相互作用，從而進行多靶點、多通路協(xié)同治療，僅從局部所在通路入手太過片面。網(wǎng)絡(luò)藥理學的這種系統(tǒng)性、整體性研究特點，與中醫(yī)治病原則不謀而合[31]?；凇八幬?成分-靶點-疾病-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析結(jié)果能有效地揭示三仙湯治療骨質(zhì)疏松可能存在的活性成分及其作用機制，為中藥方劑對疾病的研究提供了新的研究思路，后續(xù)將在此研究基礎(chǔ)上對相關(guān)靶點進一步優(yōu)化實驗設(shè)計。但本研究只是借助各種網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)資源平臺所預(yù)測的結(jié)果，此外，考慮各種數(shù)據(jù)庫的更新時效性以及數(shù)據(jù)文章選用的可信度，使得網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究有著一定的困難，因此課題組將在近期對預(yù)測的結(jié)果加以實驗驗證，以確保數(shù)據(jù)的可行性。