UPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿和腦脊液中利奈唑胺的濃度

范理菊，吳 茵，董占軍1,

(1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，石家莊 050017；2.河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050051)

醫(yī)院獲得性顱內(nèi)感染是顱腦術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，發(fā)生率為2.6%，病死率高達(dá)21%[1]。G+菌是顱內(nèi)感染的主要病原菌[2]。利奈唑胺的組織穿透力強(qiáng)，口服生物利用度高，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)G+菌感染有很好的療效[3]，是治療神經(jīng)外科術(shù)后醫(yī)院獲得性顱內(nèi)感染的常用藥物。研究發(fā)現(xiàn)，利奈唑胺在無(wú)腦膜感染人群中的腦脊液藥-時(shí)曲線下面積與血漿藥-時(shí)曲線下面積的比值約為0.7[4]，具有良好的中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透性，但個(gè)體間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異較大。并且當(dāng)患者的病理、生理狀態(tài)變化時(shí)，其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)也會(huì)隨之改變[5-6]。因此，在治療患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的重癥患者時(shí)，有必要對(duì)其進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，以?xún)?yōu)化個(gè)體化給藥方案[7]。國(guó)外已有利奈唑胺在腦膜感染患者中的藥動(dòng)學(xué)研究，并推薦了使用劑量[8-9]，但利奈唑胺在國(guó)內(nèi)神經(jīng)外科術(shù)后顱內(nèi)感染患者的腦脊液及血漿中藥動(dòng)學(xué)研究資料非常有限[10]。本研究建立了UPLC-MS/MS法測(cè)定血漿及腦脊液中利奈唑胺的濃度，從而探究利奈唑胺血漿濃度與腦脊液濃度的相關(guān)性，從而為利奈唑胺在術(shù)后顱內(nèi)感染患者的藥動(dòng)學(xué)研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。國(guó)外已有兩種基質(zhì)中利奈唑胺濃度測(cè)定的報(bào)道[11-12]，目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的有兩項(xiàng)研究[13-14]，均采用HPLC法，其特異性和靈敏度不及LC-MS/MS法。考慮到同位素稀釋質(zhì)譜是國(guó)際公認(rèn)的一級(jí)測(cè)量原理[15]，因此本研究建立同位素稀釋的UPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿和腦脊液中利奈唑胺濃度，可以在3 min內(nèi)完成血漿和腦脊液中利奈唑胺濃度測(cè)定，簡(jiǎn)便、高效、經(jīng)濟(jì)，適用于臨床測(cè)定危重癥患者血漿和腦脊液中利奈唑胺的濃度。

1 材 料

1.1 儀器 LC-30A 型超高效液相色譜儀，配有 CTO30A 型柱溫箱、SIL30AC 型自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-30AD二元高壓梯度泵(日本 Shimadzu 公司)；AB Sciex 5500型串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源、三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器；Analyst 1.6.1數(shù)據(jù)采集軟件(美國(guó)AB公司)。

1.2 藥品和試劑 利奈唑胺對(duì)照品(批號(hào)1029-084A1)、利奈唑胺-d3對(duì)照品(批號(hào)1219-006A2)由美國(guó)TLC公司提供；人工腦脊液(批號(hào)0316A20，北京雷根生物技術(shù)有限公司)；二甲亞砜(DMSO)、乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.5 μm),柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)，梯度洗脫(0～1.0 min，80%～35%A，1.0～2.1 min，35%～80%A)；流速：0.5 ml/min；進(jìn)樣量：3 μl。

2.2 質(zhì)譜條件 正離子監(jiān)測(cè)模式；離子源溫度600 ℃；源噴射電壓5500 V；霧化氣和加熱氣壓力均為55 psi(1 psi=6.894 76 kPa)；氣簾氣35 psi；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；利奈唑胺監(jiān)測(cè)離子對(duì)為m/z338.1→295.9，去簇電壓(DP)110 eV，碰撞電壓(CE)32 eV；利奈唑胺-d3的監(jiān)測(cè)離子對(duì)為m/z341.3→297.2，DP 110 eV，CE 30 eV。利奈唑胺和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 利奈唑胺和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖Figure 1 Mass spectrograms of linezolid and internal standardA:利奈唑胺；B:內(nèi)標(biāo)利奈唑胺-d3

2.3 溶液的配制 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：精密稱(chēng)取利奈唑胺對(duì)照品適量，加DMSO溶解，配成質(zhì)量濃度為1.00 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用乙腈-水(2∶8)稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度分別為2、4、10、20、50、100、150、200 μg/ml的系列對(duì)照品溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。(2)質(zhì)控工作液：另取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用乙腈-水(2∶8)稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度分別為5、40、160、400 μg/ml的質(zhì)控工作液。上述溶液置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?3)內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱(chēng)取利奈唑胺-d3適量，用DMSO溶解，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，用乙腈稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度為0.2 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，置4 ℃冰箱冷藏保存。

2.4 樣品預(yù)處理

2.4.1 血漿樣品預(yù)處理 取血漿樣品40 μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液200 μl，沉淀蛋白質(zhì)，渦旋5 min后，以相對(duì)離心力1.372 6×104×g高速離心8 min，取上清液20 μl，加入乙腈-水(2∶8)380 μl，混勻，備測(cè)。

2.4.2 腦脊液樣品預(yù)處理 取腦脊液樣品40 μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液200 μl，沉淀蛋白質(zhì)，渦旋5 min，以相對(duì)離心力1.372 6×104×g離心8 min，取上清液20 μl，加乙腈-水(2∶8)380 μl，混勻，備測(cè)。

2.5 專(zhuān)屬性 取空白血漿樣品及定量下限的血漿樣品各6份，按2.4項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣分析。腦脊液樣品參照血漿樣品。結(jié)果顯示，利奈唑胺和內(nèi)標(biāo)出峰位置背景干凈，無(wú)雜峰干擾。血漿樣品中利奈唑胺和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.18和1.17 min；腦脊液樣品中利奈唑胺和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.25和2.24 min。見(jiàn)圖2。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.6.1 血漿樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線 取空白血漿380 μl，精密加入系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液各20 μl，渦旋混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線用血漿樣品。取空白血漿380 μl，精密加入系列濃度的質(zhì)控工作液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.25、2、4、8 μg/ml的質(zhì)控血漿樣品。按2.4.1項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣分析。以血漿中待測(cè)物的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.531x+0.006 35(r=0.999 4)。結(jié)果表明，利奈唑胺血藥濃度檢測(cè)的線性范圍為0.1～10.0 μg/ml，定量下限為0.1 μg/ml。

2.6.2 腦脊液樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線 取人工腦脊液380 μl，精密加入系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液20 μl，渦旋混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線用腦脊液樣品。取人工腦脊液380 μl，精密加入系列濃度的質(zhì)控工作液，制成質(zhì)量濃度分別為0.25、2、4、8 μg/ml的質(zhì)控腦脊液樣品。按2.4.2項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣分析，以腦脊液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.479x-0.002 65(r=0.999 8)。利奈唑胺腦脊液濃度檢測(cè)的線性范圍為0.1～10.0 μg/ml，定量下限為0.1 μg/ml。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取利奈唑胺低、高質(zhì)量濃度(0.25、8 μg/ml)質(zhì)控血漿樣品各6份，按2.4.1項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣分析，分別考察其凍融3次、冷凍7 d及室溫放置6 h的穩(wěn)定性。腦脊液樣品的穩(wěn)定性考察方法同血漿樣品操作，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，各樣品RSD均<10%，提示該方法穩(wěn)定性良好。

表1 血漿和腦脊液樣品的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability test of plasma and cerebrospinal fluid samples (n=6，%)

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 取利奈唑胺定量下限、低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品各5份，按2.4.1項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣檢測(cè)，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度。腦脊液樣品的精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定方法同血漿樣品操作。結(jié)果顯示，各質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間RSD均<10%，見(jiàn)表2。

表2 血漿和腦脊液中利奈唑胺的精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision and accuracy tests of linezolid in plasma and cerebrospinal fluid samples (%)

2.9 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 平行制備低、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品各6 份，按照2.4.1項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，記錄峰面積為 C。空白血漿按照2.4.1項(xiàng)下方法提取后，添加低、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備 6 份，進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積為 B。同濃度的質(zhì)控工作溶液，不經(jīng)處理直接進(jìn)樣，記錄峰面積為 A。提取回收率=(C/B)×100%，基質(zhì)效應(yīng)=(B/A)×100%。腦脊液樣品的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率測(cè)定同血漿樣品，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 血漿和腦脊液中利奈唑胺的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率Table 3 Matrix effects and extraction recoveries of linezolid in plasma and cerebrospinal fluid

2.10 稀釋可靠性 將血漿樣品用空白血漿稀釋10倍,平行制備6份，按2.4.1項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣分析。腦脊液樣品的稀釋可靠性操作同血漿樣品，精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，樣品稀釋10倍對(duì)濃度測(cè)定無(wú)顯著影響。

3 討 論

利奈唑胺脂溶性高、分子質(zhì)量小、血腦屏障穿透性好,現(xiàn)已廣泛用于治療G+菌所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[16]。郭明星等報(bào)道了用LC-MS/MS法測(cè)定利奈唑胺血漿藥物濃度，但采用的是非同位素內(nèi)標(biāo)[17-18]。本研究采用利奈唑胺-d3同位素內(nèi)標(biāo)，色譜分析條件下，利奈唑胺和內(nèi)標(biāo)有相近的色譜保留時(shí)間，被分析物的出峰時(shí)間不受時(shí)間限制，同時(shí)利奈唑胺與內(nèi)標(biāo)具有相似的離子化效率和提取回收率[19]，最大程度地降低了基質(zhì)效應(yīng)，提高了利奈唑胺濃度測(cè)定的準(zhǔn)確度。

本研究采用梯度洗脫方式，以甲酸水溶液(含0.1%甲酸，V/V)為流動(dòng)相A相，乙腈為流動(dòng)相B相。在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸提高了利奈唑胺的離子化效率和檢測(cè)靈敏度。血漿樣品中組分復(fù)雜，采用梯度洗脫的方式，可以使復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分易于分離，縮短分析時(shí)間。預(yù)實(shí)驗(yàn)還比較了不同比例的乙腈-水溶液(2∶8和3∶7)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用2∶8的乙腈-水溶液作為溶劑，在準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)等方面更符合實(shí)驗(yàn)要求。常用的生物樣本預(yù)處理方法有固相萃取法、液液萃取法和蛋白沉淀法。固相萃取法時(shí)間短，效率高，但成本高。液液萃取法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，不適用于醫(yī)院常規(guī)樣品的批量測(cè)定。本研究采用乙腈為沉淀劑的前處理方法，操作簡(jiǎn)便、成本低廉、提取回收率高，適用于醫(yī)院的治療藥物監(jiān)測(cè)。本研究還將內(nèi)標(biāo)溶解于沉淀劑中，一是減少了因內(nèi)標(biāo)加樣量少引起的人為誤差，二是簡(jiǎn)化了樣本預(yù)處理步驟，縮短了預(yù)處理時(shí)間，為臨床危重癥患者的藥物治療爭(zhēng)取了時(shí)間。

綜上所述，本研究建立的UPLC-MS/MS同位素稀釋法可以滿(mǎn)足臨床患者血漿和腦脊液中利奈唑胺的濃度測(cè)定，值得推廣應(yīng)用。