QuEChERS-HPLC-MS/MS法檢測(cè)谷物源性運(yùn)動(dòng)食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素

閆志光，田部男

（1.內(nèi)蒙古體育職業(yè)學(xué)院 青少年訓(xùn)練系，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古集寧一中，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000）

雜色曲霉毒素（sterigmatocystin，SMC）、黃曲霉毒素（aflatoxins，AFTs）兩者結(jié)構(gòu)相似，都具有較強(qiáng)的致癌性，普遍存在于大米、小麥、玉米等谷物中[1-3]，常協(xié)同污染谷物及其制品。攝入被雜色曲霉毒素或者黃曲霉毒素污染的谷物易致癌、致畸，還極易在體內(nèi)蓄積殘留，嚴(yán)重威脅人類健康[4-5]。谷物源性運(yùn)動(dòng)食品是指以谷物類原料制成的針對(duì)運(yùn)動(dòng)人群開(kāi)發(fā)的一類補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)素的食品。因其是針對(duì)特殊人群研發(fā)的一種食品，對(duì)安全性要求高，所以需要對(duì)這類產(chǎn)品中相關(guān)毒素殘留情況進(jìn)行監(jiān)控。

目前對(duì)食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的測(cè)定方法主要有薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandemmassspectrometry，HPLC-MS/MS）等[6-11]。TLC法具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但重復(fù)性差，往往作為定性篩查方法；HPLC法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、普及性廣等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品存在雜峰干擾等問(wèn)題；HPLCMS/MS法具有分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，采用同位素內(nèi)標(biāo)法可準(zhǔn)確定量，可作為定性定量檢測(cè)食品中雜色曲霉毒素的確證方法。本研究運(yùn)用QuEChERS前處理凈化技術(shù)，避免一般前處理耗材成本較高的問(wèn)題[12-13]，并依據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)器具有特異選擇性以及高靈敏度的特性[14]，提高了方法的檢出限和定量限，可為谷物源性運(yùn)動(dòng)食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雜色曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.0 μg/mL），黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）B1、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（200.0 μg/mL）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科學(xué)科技有限公司；C18吸附劑：美國(guó)Agilent科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純）：美國(guó)Merck公司；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；植物蛋白營(yíng)養(yǎng)粉（大豆蛋白）、小麥低聚肽運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)粉、花生低聚肽運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)粉、玉米肽運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化粉：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30A高效液相色譜儀：日本島津公司；AB SCIEX Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)AB SCIEX公司；TD-5高速離心機(jī)：上海盧湘儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

稱取谷物源性運(yùn)動(dòng)食品5.0 g，加入20 mL提取液，超聲提取10 min。將鹽析劑[15-16]（無(wú)水硫酸鎂/氯化鈉/檸檬酸鈉二水合物/檸檬酸氫二鈉鹽倍半水合物=4∶1∶1∶0.5（g∶g））加入樣品中混勻后4 000 r/min離心2 min。吸取1.0 mL上清液并加入凈化劑，渦旋1 min后4 000 r/min離心2 min，取上清液過(guò)濾后進(jìn)行分析。比較不同的提取液（乙腈-水（85∶15，V/V）、乙腈-水（70∶30，V/V）、甲醇-水（85∶15，V/V）、乙腈-水-甲酸（85∶14∶1，V/V））、凈化劑組合（30 mgSiO2+30mgC18、30 mg NH2+30 mgC18、30 mg弗羅里硅土+30 mg C18）對(duì)5種真菌毒素檢測(cè)效果的影響[17-21]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取適量的雜色曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以甲醇為溶劑配制成質(zhì)量濃度0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于棕色瓶中避光保存。

1.3.3 液相色譜條件

選用Atalantis T3耐高壓色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；樣品進(jìn)樣量為2.0 μL；流動(dòng)相A為0.15%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速為0.2 mL/min；梯度洗脫條件為0～0.5 min 90%A，2.0～5.0 min 10%A，5.1～10.0 min 90%A。

1.3.4 質(zhì)譜條件[22-25]

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）：正離子電離（ESI+）；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple-reaction monitoring，MRM）；離子源溫度：105 ℃；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣流量：10 L/min；錐孔流量：0.5 L/min；去溶劑溫度：400 ℃；其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5種真菌毒素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of multi reaction monitoring scanning mode for 5 mycotoxins

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

為了使雜色曲霉毒素、4種黃曲霉毒素能夠有效分離，比較了在不同組分流動(dòng)相（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液）條件下5種目標(biāo)物的響應(yīng)值和峰形，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，流動(dòng)相體系中含有乙腈會(huì)改善起到增強(qiáng)目標(biāo)物響應(yīng)值的作用，在水相中加入0.1%甲酸溶液時(shí)雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素的響應(yīng)值較高，與其他3種流動(dòng)相相比具有顯著性差異（P＜0.05），因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相對(duì)5種真菌毒素響應(yīng)值的影響Fig.1 Effect of different mobile phases on response value of 5 mycotoxins

2.1.2 流動(dòng)相中甲酸溶液的優(yōu)化

由于雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素屬于極性化合物[16]，流動(dòng)相的組成會(huì)影響目標(biāo)物的分離和離子化效率，從而影響到檢測(cè)的靈敏度。為了促進(jìn)目標(biāo)化合物的離子化，選擇乙腈和甲酸溶液作為流動(dòng)相的組成，其中甲酸含量分別為0.05%、0.10%、0.15%和0.20%。結(jié)果表明，當(dāng)甲酸溶液為0.15%時(shí)，雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素的離子化效果最好，離子豐度最強(qiáng)，因此選擇0.15%甲酸溶液與乙腈組成流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

在乙腈-0.15%甲酸溶液得到5種真菌毒素的總離子流圖見(jiàn)圖2。由圖2可知，雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素的離子化效果最好，離子豐度最強(qiáng)。

圖2 乙腈-0.15%甲酸溶液流動(dòng)相條件下5種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatogram of 5 mycotoxins standard using acetonitrile-0.15% formic acid solution as mobile phase

2.2 QuEChERS前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取液的選擇

真菌毒素化合物易溶于甲醇、乙腈、水等極性溶劑中，常用提取液有乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水-甲酸等類型[17-19]。本試驗(yàn)具體比較了4種提取溶劑：乙腈-水（85∶15，V/V）、乙腈-水（70∶30，V/V）、甲醇-水（85∶15，V/V）、乙腈-水-甲酸（85∶14∶1，V/V）。試驗(yàn)以大豆基質(zhì)的谷物源性運(yùn)動(dòng)食品為對(duì)象，并添加5種真菌毒素制得陽(yáng)性質(zhì)控樣品（加標(biāo)量均為1 μg/kg，混合均勻后放置一周檢測(cè)）。比較不同類型提取液對(duì)樣品中雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素提取效果的影響，結(jié)果以5種真菌毒素的測(cè)定值為比較依據(jù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同提取液對(duì)5種真菌毒素回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solution on recovery rate of 5 mycotoxins

由圖3可知，不同提取液對(duì)雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素的回收率存在顯著差異（P＜0.05），當(dāng)選擇乙腈-水（85∶15，V/V）作為提取液時(shí)，加標(biāo)樣品中5種真菌毒素的檢出含量最高，能達(dá)到0.53～0.71 μg/kg。在此比例的提取液中，5種極性化合物的真菌霉素在提取液中的分配系數(shù)高，故目標(biāo)物的測(cè)定值較理想。

2.2.2 凈化劑的優(yōu)化

由圖4可知，3組凈化劑組合對(duì)加標(biāo)樣品中雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素檢測(cè)含量的影響差異顯著（P＜0.05），30 mg SiO2+30 mg C18的組合對(duì)凈化谷物源性運(yùn)動(dòng)食品的效果較好，加標(biāo)樣品中5種真菌毒素的檢測(cè)含量能達(dá)到0.86～0.97 μg/kg，所以本試驗(yàn)選擇了30 mg SiO2+30 mg C18作為凈化劑組合效果較好。

圖4 不同凈化劑組合對(duì)5種真菌毒素回收率的影響Fig.4 Effect of different combinations of purifying agents on recovery rate of 5 mycotoxins

2.3 方法的線性范圍與靈敏度

在乙腈-0.15%甲酸流動(dòng)相體系中，按上述條件進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取5種真菌毒素最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察色譜保留時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），以信噪比（S/N）=10計(jì)算定量限（limit of quantitation，LOQ），以S/N=3計(jì)算檢出限（limit of detection，LOD）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果5種目標(biāo)組分在0.1～10.0 ng/mL范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5種真菌毒素的保留時(shí)間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 2 Retention time,linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of 5 mycotoxins

2.4 方法的精密度與回收率

在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，選用谷物源性運(yùn)動(dòng)食品常見(jiàn)的小麥粉基質(zhì)、玉米基質(zhì)、大豆基質(zhì)、花生基質(zhì)共4種基質(zhì)（樣品5種真菌毒素均未檢出），分別對(duì)3種不同加標(biāo)量（SMC：0.5 μg/kg、5 μg/kg和10 μg/kg，AFB1、AFG1：0.2 μg/kg、2 μg/kg和4μg/kg，AFB2：0.1μg/kg、1μg/kg和2μg/kg，AFG2：0.4μg/kg、4 μg/kg和8 μg/kg）的加標(biāo)樣品連續(xù)5次的測(cè)定進(jìn)行評(píng)價(jià)，考察谷物源性運(yùn)動(dòng)食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的回收率及方法精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 谷物源性運(yùn)動(dòng)食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的回收率及方法精密度試驗(yàn)Table 3 Recovery rate and method precision test of sterigmatocystin and aflatoxins in cereal-derived sports food

由表3可見(jiàn)，在4種不同的谷源性運(yùn)動(dòng)食品基質(zhì)中，雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素的平均回收率為85.8%～99.4%，方法精密度RSD為2.72%～5.23%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和精密度可行。

2.5 實(shí)際樣品分析

通過(guò)本試驗(yàn)建立的HPLC-MS/MS方法對(duì)市售的20份谷源性運(yùn)動(dòng)食品中的雜色曲霉毒素和4種黃曲霉毒素進(jìn)行定量分析。20份樣品中均未檢出雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素，整體情況良好。

3 結(jié)論

本研究建立的QuEChERS-HPLC-MS/MS檢測(cè)谷物源性運(yùn)動(dòng)食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的分析方法，可有效去除谷物源性運(yùn)動(dòng)食品中的干擾物對(duì)目標(biāo)峰的影響，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中5種真菌毒素類的定性和定量分析。樣品經(jīng)乙腈-水（85∶15，V/V）提取后，再由30 mg SiO2+30 mg C18凈化劑組合處理，在4種不同的源性基質(zhì)中加標(biāo)回收率能達(dá)到85.8%～99.4%，并具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。適用于谷物源性運(yùn)動(dòng)食品中雜色曲霉毒素和黃曲霉毒素的分析和定量檢測(cè)。