miR-101、miR-122在妊娠期糖尿病患者血清和胎盤組織中表達(dá)及意義

陳麗霞，張秀薇，禤文婷，尹鎮(zhèn)釗，陳松錦 （廣東省東莞市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東東莞 523000）

妊娠期糖尿?。℅DM）是妊娠期較為常見的并發(fā)癥，其指妊娠起始或妊娠過程中出現(xiàn)葡萄糖耐量受損。目前對于GDM 發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，既往相關(guān)研究指出孕產(chǎn)婦高雌激素水平與其胰島素抵抗有關(guān)，認(rèn)為胰島素抵抗是GDM 重要的病理機(jī)制[1]。近年來，隨著GDM發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展，越來越多的研究證實多種miRNA 直接或間接參與GDM 的生物學(xué)行為機(jī)制進(jìn)程，其中miR?101 可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，與糖脂代謝異常、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[2]；而miR?122 也被證實其參與了胰島素分泌、糖酵解、脂肪細(xì)胞分化等生物學(xué)過程的調(diào)控[3]。因此，筆者認(rèn)為兩者可能與GDM的發(fā)生與進(jìn)展、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移與侵襲等具有一定關(guān)聯(lián)。因此，本研究通過分析GDM 患者血清及胎盤中miR?101 和miR?122 的表達(dá)水平情況，分析其與胰島素抵抗的相關(guān)性，以明確miR?101與miR?122在GDM預(yù)測、治療及預(yù)后中的作用及意義。

1 資料和方法

1.1 病例與分組

選取2018年7月至2019年12月在東莞人民醫(yī)院建檔產(chǎn)檢并分娩的GDM 孕婦42 例為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合GDM 診斷標(biāo)準(zhǔn)，即行口服葡萄糖耐量試驗顯示：空腹血糖≥5.1 mmol/L；1 h血糖≥10.0 mmol/L；2 h 血糖≥8.5 mmol/L，滿足任意一項即可診斷為GDM；(2)妊娠>16周；(3)在本院規(guī)律產(chǎn)檢。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往無糖尿病或糖尿病家族史；(2)妊娠期高血壓、高血脂、心臟病等其他妊娠合并癥；(3)雙胎妊娠；(4)全身感染性疾病。本研究已通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬知情且簽署同意書。并隨機(jī)選取同期健康孕婦30例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有孕產(chǎn)婦均于清晨空腹時采集靜脈血取血清，?20 ℃冰箱中待檢。胎盤組織獲取于胎兒與胎盤娩出后，生理鹽水洗凈，取胎盤中央母體面臍帶根部組織5 mm×5 mm×5 mm 大小2～4 塊組織物，約重120 mg，靜置?80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 RNA 提取 采用RNAeasy extraction Kit 試劑提取血清RNA，用Trizol 試劑提取胎盤組織中RNA，同時采用Nanodrop 2 000 紫外可見分光光度計進(jìn)行兩樣本中RNA 濃度及純度檢測。所有步驟均按試劑盒說明操作。

1.2.3 miRNA 逆轉(zhuǎn)錄 采用miRNA 逆轉(zhuǎn)錄及特異性檢測試劑盒，引物采用miR?101 特異性RT?PCR 引物（Forward:5'?CATCTTACCGGACAGTGCTGGA?3'，下游為通用引物）檢測miR?101 的表達(dá)。采用miR?122特異性引物（Forward：5'?TGGAGTGTGACAATG?GTGTTTG?3’，下游為通用引物）miR?122的表達(dá)。

1.2.4 熒光實時定量PCR 試劑盒使用TaKaRa 公司，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)。熔解曲線檢測從65 ℃開始，每0.5 ℃檢測1 次。miRNA 表達(dá)量以2?ΔCt 表示，其中ΔCt=CtmiRNA–CtU6。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)臨床參數(shù)指標(biāo)：年齡，身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。(2)胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)：取血清，采用全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀空腹血糖（FPG）及空腹胰島素（FINS），胰島功能采用穩(wěn)態(tài)模型計算HOMA 胰島素抵抗指數(shù)（HOMA?IR）=（FPG×FINS）/22.5，HOMA 胰島素分泌指數(shù)（HOMA?IS）=（20×FINS）/FPG?3.5。(3)兩組血清及胎盤中miR?101與miR?122表達(dá)水平差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，采用t檢驗；采用Pearson 相關(guān)性分析血清miR?101與miR?122水平與臨床參數(shù)和胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床參數(shù)和胰島素相關(guān)指標(biāo)

觀察組孕產(chǎn)婦BMI、FBG、FINS、HOMA?IS 及HOMA?IR 指標(biāo)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05 或0.01），見表1。

表1 兩組臨床參數(shù)和胰島素相關(guān)指標(biāo)比較 ()

表1 兩組臨床參數(shù)和胰島素相關(guān)指標(biāo)比較 ()

與對照組比較：aP<0.05，bP<0.01

2.2 miR?101 和miR?122 在兩組血清和胎盤組織中表達(dá)水平

miR?101和miR?122在觀察組血清和胎盤組織中表達(dá)水平均明顯高于對照組（P<0.01），見表2 和圖1、2。

圖1 miR?101的qPCR擴(kuò)增曲線圖

表2 miR?101和miR?122在兩組血清和胎盤組織中表達(dá)水平比較 ()

表2 miR?101和miR?122在兩組血清和胎盤組織中表達(dá)水平比較 ()

與對照組比較：aP<0.01

2.3 各項指標(biāo)與血清miR?101 及miR?122 水平的相關(guān)性分析

血清miR?101 水平與FBG 呈正相關(guān)，與FINS、HOMA?IS 呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）；miR?122 水平與FBG、HOMA?IR 呈正相關(guān)，與FINS 呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），見表3。

表3 各項指標(biāo)與血清miR?101及miR?122水平的相關(guān)性分析

3 討論

當(dāng)前，隨著孕婦飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，GDM 發(fā)病率呈逐年上升趨勢。GDM 易造成較多種不良妊娠結(jié)局，對母嬰均有嚴(yán)重危害，甚至長遠(yuǎn)影響，早期診斷并及時治療可提高孕婦及胎兒的預(yù)后[4]。因此，新的生物學(xué)標(biāo)記物在早期診斷GDM 尤為重要。miRNA 是一類進(jìn)化過程高度保守的、廣泛參與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)展的小分子非編碼RNA，其在代謝調(diào)控和細(xì)胞功能中起到“動態(tài)調(diào)節(jié)器”的作用[5]。而近年來miRNA與GDM 的相關(guān)研究較為新穎，同時也為本研究提供了理論支持。

圖2 miR?122的qPCR擴(kuò)增曲線圖

本研究結(jié)果顯示，miR?101及miR?122水平在GDM 患者血清及胎盤組織中均呈高表達(dá)，提示兩者可能直接或間接參與了GDM的發(fā)生和發(fā)展。有多項研究證實，miR?101 可通過調(diào)控EZH2/H3K27me3 通路參與調(diào)控多種疾病的進(jìn)展，其中在胚胎橫紋肌肉瘤、肺癌、膀胱移行細(xì)胞癌中，其通過降低EZH2/H3K27me3 表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖來影響腫瘤進(jìn)展[6?8]。胎盤形成的前提是胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞對母體子宮內(nèi)膜的侵入及黏附，而miR?101 在此過程中可能通過調(diào)控EZH2/H3K27me3 通路來影響胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能，導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞遷移及增殖能力降低，參與GDM 發(fā)病[9]。而針對miR?122 而言，其是前體基因位于18q21.31位點(diǎn)，參與了糖酵解、脂肪細(xì)胞分化、胰島素分泌等代謝相關(guān)的生物學(xué)過程調(diào)控[10?11]。在胰島素抵抗細(xì)胞模型中，miR?122 呈高度表達(dá)，而通過轉(zhuǎn)染miR?122 模擬物，AMPK 基因表述水平下調(diào)，進(jìn)而加重胰島素抵抗程度[12]。另外，胰島素抵抗水平是胰島細(xì)胞功能的一個重要指標(biāo)，本研究在GDM 產(chǎn)婦胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)均比正常產(chǎn)婦的明顯增高，且在相關(guān)性分析中，GDM 產(chǎn)婦血清miR?101 水平與FBG 呈正相關(guān)，與FINS、HOMA?IS 呈負(fù)相關(guān)；miR?122 水平與HOMA?IR、FBG 呈正相關(guān)，與FINS 呈負(fù)相關(guān)。說明GDM 產(chǎn)婦在胰島素分泌狀態(tài)下，產(chǎn)婦血清miR?101表達(dá)顯著下調(diào)；而產(chǎn)婦呈胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)時，其血清miR?122 表達(dá)顯著上調(diào)，miR?122 部分的結(jié)果與禤文婷[3]等的研究結(jié)果基本一致，但對于miR?122 作用的靶向信號通路仍需作進(jìn)一步的研究與探討。

綜上，miR?101及miR?122水平在GDM產(chǎn)婦血清及胎盤中均呈高表達(dá)狀態(tài)，其可能直接或間接參與了GDM 的發(fā)生和發(fā)展。此外，miR?101 表達(dá)與胰島素分泌指數(shù)呈負(fù)相關(guān)；miR?122 表達(dá)則與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)，因此可推斷，通過干預(yù)miR?101 及miR?122 表達(dá)，可阻止胰島細(xì)胞功能的抑制或分泌，或可能成為GDM診斷、治療及預(yù)后的新靶點(diǎn)。