均相電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用研究

楊建梅， 王玲麗， 張 金， 趙 焱

（云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 云南昆明650500）

0 前言

電化學(xué)生物傳感器由于儀器便攜、 響應(yīng)快速、靈敏度高、選擇性好，因此在生命醫(yī)學(xué)、疾病診斷、食品安全及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[1-2]。 然而，傳統(tǒng)的電化學(xué)生物傳感器通常需要將生物探針固定到電極上， 不僅固定過程耗時(shí)費(fèi)力， 而且傳感體系中涉及到的反應(yīng)發(fā)生在電極界面與溶液（固-液）兩相介質(zhì)中，使反應(yīng)的速率受到一定的限制，進(jìn)而影響傳感器的檢測(cè)性能[3-4]。 均相電化學(xué)生物傳感器不需要將生物探針固定在電極表面， 避免了繁瑣耗時(shí)的固定化過程， 彌補(bǔ)了傳統(tǒng)電化學(xué)生物傳感器所存在的不足[5-6]。 系統(tǒng)深入的探究均相電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建策略可以為電化學(xué)生物傳感器的進(jìn)一步發(fā)展提供有力的理論支撐，從而加速均相電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展進(jìn)程。 該文簡要介紹了電化學(xué)生物傳感器的工作原理及分類，重點(diǎn)討論了均相及非均相電化學(xué)生物傳感器各自的特點(diǎn)，并分析了兩類均相電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建策略。 旨在為均相電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建和發(fā)展提供理論依據(jù)和支撐，從而加速均相電化學(xué)生物傳感器的研究進(jìn)展。

1 電化學(xué)生物傳感器概述

1.1 電化學(xué)生物傳感器的原理

電化學(xué)生物傳感器是指用固定化的生物體成分（酶、核酸、蛋白質(zhì)，抗原、抗體、激素等）或生物體本身（細(xì)胞、細(xì)胞器、組織等）生物材料作為敏感元件，電極作為轉(zhuǎn)換元件，以電流、電阻或者電位作為特征檢測(cè)信號(hào)的傳感器[7]。 電化學(xué)生物傳感器主要由生物識(shí)別元件、 信號(hào)轉(zhuǎn)換器及數(shù)據(jù)分析儀三個(gè)部分組成。其工作原理如下，首先通過被測(cè)物質(zhì)與生物識(shí)別元件間特異性的相互作用完成生物識(shí)別過程；然后通過電極作為信號(hào)轉(zhuǎn)換裝置將生物識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)換為可測(cè)的電化學(xué)信號(hào)，如電流、電阻、電位等；最后通過數(shù)據(jù)分析儀將信號(hào)輸出，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)被測(cè)物定性或定量的分析[8]。

1.2 電化學(xué)生物傳感器的分類

根據(jù)生物識(shí)別元件的不同，可以將電化學(xué)生物傳感器分為電化學(xué)酶生物傳感器、電化學(xué)DNA生物傳感器、電化學(xué)免疫生物傳感器、電化學(xué)適體生物傳感器及電化學(xué)細(xì)胞生物傳感器等[9]； 根據(jù)信號(hào)輸出方式的不同，則可以將電化學(xué)生物傳感器分為電阻型電化學(xué)生物傳感器、電流型電化學(xué)生物傳感器、電位型電化學(xué)生物傳感器、及電容型電化學(xué)生物傳感器等[10]；此外，還可以根據(jù)傳感體系中反應(yīng)發(fā)生所處介質(zhì)的不同，將其分為非均相電化學(xué)生物傳感器和均相電化學(xué)生物傳感器。 該文主要從傳感體系中反應(yīng)發(fā)生所處介質(zhì)的不同，討論非均相和均相電化學(xué)生物傳感器各自的特點(diǎn)，并分析兩種傳感器常見的構(gòu)建策略。

1.3 非均相電化學(xué)生物傳感器

非均相電化學(xué)生物傳感器也稱作固定化電化學(xué)生物傳感器，一般采用固體電極作為傳感界面，將生物識(shí)別元件固定到電極表面，目標(biāo)生物分子通過與敏感元件間的特異性相互作用被捕獲到電極表面，使電極表面的電子傳遞系統(tǒng)受到影響，從而改變傳感體系中的電化學(xué)信號(hào)。 根據(jù)電化學(xué)信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)物質(zhì)的定性或定量檢測(cè)。 這種傳統(tǒng)的非均相電化學(xué)生物傳感器通常需要先將生物識(shí)別元件固定在電極的表面，由此帶來了很多問題：（1） 為了將生物識(shí)別元件固定到電極表面，電極要經(jīng)歷“清洗-打磨-修飾”等多個(gè)繁瑣的預(yù)處理過程，增加了傳感器構(gòu)建的成本，耗費(fèi)了大量的時(shí)間；（2）生物識(shí)別元件在電極表面固定的效率較低或是固定不穩(wěn)定，不僅浪費(fèi)試劑藥品，還會(huì)影響傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性；（3） 電極預(yù)處理及修飾等構(gòu)建過程難免會(huì)存在一定的差異性，由此不可避免的會(huì)給檢測(cè)結(jié)果帶來相應(yīng)的檢測(cè)偏差；（4） 將生物識(shí)別元件固定到電極表面不僅會(huì)產(chǎn)生較大的空間位阻效應(yīng)，還會(huì)改變識(shí)別分子的幾何形狀，降低結(jié)構(gòu)自由度，影響生物分子間的識(shí)別及結(jié)合效率，進(jìn)而影響傳感器的靈敏度；（5） 傳感體系中涉及到的反應(yīng)發(fā)生在溶液與電極界面（“液-固”）兩相非均相介質(zhì)中， 使得反應(yīng)的速率受到一定的限制，因此會(huì)影響傳感器的靈敏度。 生物傳感器的性能大都依賴于生物探針的表面固定化，因此生物探針固定化是制約電化學(xué)生物傳感器進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸。

1.4 均相電化學(xué)生物傳感器

均相電化學(xué)生物傳感器是指不需要將生物識(shí)別元件固定到電極表面，生物識(shí)別過程及傳感體系中涉及到的其它反應(yīng)過程都在均相溶液中進(jìn)行的免固定化的傳感器。 利用目標(biāo)分析物引發(fā)信號(hào)分子擴(kuò)散或者吸附在電極表面，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的檢測(cè)。 與傳統(tǒng)的電化學(xué)生物傳感器相比，免生物探針固定的均相電化學(xué)生物傳感器不論在傳感器構(gòu)建過程中，還是傳感器的檢測(cè)性能方面都凸顯出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：（1） 避免了繁瑣的電極處理及修飾等過程，進(jìn)一步簡化了電化學(xué)生物傳感器的操作步驟，降低了傳感器構(gòu)建的成本；（2）無需將識(shí)別元件固定到電極表面，所有加入傳感體系內(nèi)的生物分子均可以充分的參與反應(yīng)，不會(huì)造成試劑藥品的浪費(fèi)；（3）避免了電極預(yù)處理及修飾等構(gòu)建過程的差異性，減小了檢測(cè)結(jié)果的偏差；（4） 參與反應(yīng)的生物分子脫離了電極的束縛，恢復(fù)到最佳的幾何形態(tài)及自由度，可以自由的參與反應(yīng)， 同時(shí)保持最佳的生物活性、生物識(shí)別及結(jié)合能力，提高了生物分子間的結(jié)合效率，進(jìn)而提升了傳感器的靈敏度；（5）所有的反應(yīng)在均相溶液中進(jìn)行，使得參與反應(yīng)的生物分子可以進(jìn)行高效的碰撞， 不僅可以加快反應(yīng)速率，還可以確保反應(yīng)的有序進(jìn)行，從而保證了傳感器的靈敏度。 近年來，基于上述這些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，一系列簡單、快速、靈敏的均相電化學(xué)生物傳感器相繼被報(bào)道。 均相電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展彌補(bǔ)了傳統(tǒng)電化學(xué)生物傳感器所存在的不足，使電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用變得更加的簡單方便。 系統(tǒng)深入地探究均相電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建策略可以為電化學(xué)生物傳感器的進(jìn)一步發(fā)展提供有力的理論支撐，從而加速均相電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展進(jìn)程。

1.5 非均相與均相電化學(xué)生物傳感器性能比較

表1 對(duì)非均相和均相電化學(xué)生物傳感器在核酸、蛋白質(zhì)、小分子等檢測(cè)中的性能進(jìn)行了比較。 從表中對(duì)比結(jié)果可以看出，非均相電化學(xué)生物傳感器構(gòu)建過程中，其電極處理及修飾所需的時(shí)間通常達(dá)幾個(gè)小時(shí)以上。 然而均相電化學(xué)生物傳感器不需要生物探針在電極表面的固定，避免了長達(dá)數(shù)小時(shí)的電極處理和修飾過程。 更重要的是，均相電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)性能與非均相電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)性能相當(dāng)， 甚至更優(yōu)。由此可見，均相電化學(xué)生物傳感器在生物分析檢測(cè)中具有很大的優(yōu)勢(shì)，相信其將會(huì)在未來電化學(xué)生物檢測(cè)中發(fā)揮重要的作用。

表1 非均相電化學(xué)生物傳感器和均相電化學(xué)生物傳感器性能比較Tab.1 Performance comparison of traditional heterogeneous electrochemical biosensors and homogeneous electrochemical biosensors

2 均相電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用研究

在均相電化學(xué)生物傳感器中，電化學(xué)信號(hào)的產(chǎn)生主要通過電活性分子在電極表面的擴(kuò)散或吸附兩種形式實(shí)現(xiàn)。 根據(jù)電活性分子與電極表面接觸方式的不同，可以將均相電化學(xué)生物傳感器分為擴(kuò)散介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器及親和介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器兩類。 接下來將對(duì)這兩類均相電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建策略進(jìn)行分析總結(jié)。

2.1 擴(kuò)散介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器

擴(kuò)散介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器是基于不同存在形式電活性分子在電極表面擴(kuò)散速率的不同而發(fā)展起來的傳感器。 電活性分子擴(kuò)散到電極表面后，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的分析檢測(cè)。 在這類傳感器中，通常采用銦錫氧化電極（ITO 電極）作為工作電極，DNA 作為生物探針。 ITO 電極表面帶有大量的負(fù)電荷，DNA 的磷酸骨架使其帶有負(fù)電荷。 因此研究者通常利用酶剪切或DNA 自組裝等途徑改變DNA 的結(jié)構(gòu)，從而改變DNA 結(jié)構(gòu)與ITO 電極間靜電作用力的大小， 實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的定量分析與檢測(cè)。

2.1.1 基于酶剪切-擴(kuò)散介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器

酶剪切-擴(kuò)散介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建通常采用以下的方式： 合理的設(shè)計(jì)DNA結(jié)構(gòu)， 使標(biāo)記有電活性物質(zhì)的DNA 探針在沒有目標(biāo)物時(shí)與電極間有較大的靜電排斥力，加入目標(biāo)物后，引發(fā)DNA 結(jié)構(gòu)的變化，使其能被酶識(shí)別剪切，形成單核苷酸片段，與電極間的排斥力減小，從而使得標(biāo)記有電活性物質(zhì)的核苷酸片段靠近電極表面，產(chǎn)生電流信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的定量檢測(cè)。

香港科技大學(xué)I-Ming Hsing 教授課題組在2011 年首次提出了免固定的均相電化學(xué)生物傳感器的概念，并發(fā)展了一系列新型的免固定化的電化學(xué)生物傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種生物分子的均相檢測(cè)[21-23]。 例如在2013 年，該課題組借助汞離子（Hg2+）誘導(dǎo)DNA 鏈的構(gòu)象變化及核酸外切酶-III（Exo-III）剪切構(gòu)建了免固定電化學(xué)生物傳感器，對(duì)Hg2+進(jìn)行了均相電化學(xué)檢測(cè)[22]。 如圖1 所示，當(dāng)沒有Hg2+存在時(shí)，標(biāo)記有電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)（MB）的DNA 鏈與ITO 電極間存在較大的排斥力，導(dǎo)致DNA 鏈無法靠近電極，因此產(chǎn)生的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)很弱。 而向體系中加入Hg2+時(shí)，Hg2+誘導(dǎo)DNA 單鏈發(fā)生構(gòu)型變化， 形成能被Exo-III 識(shí)別的DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，Exo-III 酶將其剪切為單核苷酸片段，使標(biāo)記有MB 的核苷酸與電極間的排斥力減小。 此時(shí)，標(biāo)記有MB 的核苷酸可以靠近電極表面， 產(chǎn)生較大的電流響應(yīng)信號(hào)?；诖?， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+快速簡單的均相檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)0．2 nmol/L。 該均相電化學(xué)生物傳感器無需繁雜的電極打磨和修飾等預(yù)處理過程， 十分簡單便捷， 為金屬離子的檢測(cè)提供了新的檢測(cè)平臺(tái)。

圖1 擴(kuò)散介導(dǎo)的免固定均相電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)Hg2+的原理示意圖[22]Fig．1 Illustration of the Hg2+detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[22]

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)李峰教授課題組也在均相電化學(xué)生物傳感器方面做了大量的研究工作[24-27]。2017 年，該課題組報(bào)道了一種基于Exo-III 等溫切割循環(huán)放大的超靈敏均相電化學(xué)生物傳感器，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p50 進(jìn)行了檢測(cè)[28]。如圖2 所示，沒有目標(biāo)物存在時(shí)，標(biāo)記有亞甲基藍(lán)（MB）的發(fā)夾探針不能被Exo-III 識(shí)別剪切， 它與帶負(fù)電荷的ITO 電極間存在較大的靜電排斥力，因此無法靠近電極，只能得到一個(gè)微弱的電流信號(hào)。 而當(dāng)加入目標(biāo)物NF-κB p50 時(shí)， 發(fā)夾探針被Exo-III 識(shí)別切割，釋放出小尺寸且負(fù)電荷減少的單核苷酸-MB 片段，使MB 與ITO 電極間的排斥力減弱，MB 可以靠近電極， 產(chǎn)生放大的電流響應(yīng)信號(hào)。 基于此，該傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p50 的高靈敏檢測(cè)。 這個(gè)工作為轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)提供了一個(gè)簡單、快速且成本低的分析平臺(tái)。

圖2 擴(kuò)散介導(dǎo)的免固定均相電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)NF-κB p50 的原理示意圖[28]Fig．2 Illustration of the NF-κB p50 detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[28]

此外，還有很多科研小組也在均相電化學(xué)生物傳感器研究領(lǐng)域做出了貢獻(xiàn)。 例如南開大學(xué)的唐波教授課題組研究了一種基于核酸外切酶輔助的均相電化學(xué)生物傳感器， 對(duì)DNA 進(jìn)行高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)原理如圖3[29]。該方法為發(fā)展其他的核酸檢測(cè)方法提供了一定的理論支撐和新的途徑。 福州大學(xué)楊黃浩教授課題組提出了一種基于切刻酶輔助的均相電化學(xué)生物傳感器，對(duì)赭曲霉素A（OTA）進(jìn)行高靈敏的檢測(cè)，檢測(cè)原理如圖4所示[30]。 該方法簡單，快速，具有高靈敏度，檢測(cè)下限低達(dá)0．004 ng/mL。

圖3 擴(kuò)散介導(dǎo)的免固定均相電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)DNA 的原理示意圖[29]Fig．3 Illustration of the DNA detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[29]

圖4 擴(kuò)散介導(dǎo)的免固定均相電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)OTA 的原理示意圖[30]Fig．4 Illustration of the OTA detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[30]

2.1.2 基于DNA 自組裝-擴(kuò)散介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器

除了通過酶剪切改變DNA 結(jié)構(gòu)與電極間的排斥力之外， 還可以利用DNA 自組裝改變DNA結(jié)構(gòu)與電極間靜電排斥力的大小，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的檢測(cè)。 I-Ming Hsing 教授課題組提出了一種基于DNA 和肽核酸（PNA）自組裝構(gòu)建的均相電化學(xué)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定核酸序列的高靈敏檢測(cè)[23]。 如圖5 所示，當(dāng)沒有目標(biāo)核酸序列時(shí)，標(biāo)記有二茂鐵的PNA（Fc-PNA）由于不帶電荷，因此可以自由的移動(dòng)到ITO 電極表面，產(chǎn)生較大的電流響應(yīng)信號(hào)。 而當(dāng)存在目標(biāo)物時(shí)，目標(biāo)物引發(fā)DNA 和PNA 之間的級(jí)聯(lián)自組裝，得到樹枝狀的DNA/PNA 的納米結(jié)構(gòu)，此時(shí)，由于納米結(jié)構(gòu)中含有大量的DNA 序列， 使其帶有大量的負(fù)電荷， 與電極之間產(chǎn)生很大的排斥力， 阻礙Fc-PNA 接近電極表面，只能得到一個(gè)較小的電流響應(yīng)信號(hào)。 根據(jù)電流響應(yīng)信號(hào)的變化，即可對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量檢測(cè)。 該方法構(gòu)建簡單、靈敏度高，檢測(cè)限低達(dá)100 fmol/L， 為核酸的高靈敏且簡單快捷地檢測(cè)開辟了新途徑。

圖5 擴(kuò)散介導(dǎo)的免固定均相電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)特定核酸序列的原理示意圖[23]Fig．5 Illustration of the nucleic acids detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[23]

李峰教授課題組報(bào)道了一個(gè)免標(biāo)記、免固定化的均相電化學(xué)生物傳感器，對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑進(jìn)行了檢測(cè)[31]。 如圖6 所示，沒有殺蟲劑存在時(shí)，乙酰膽堿酶能催化HP 探針?biāo)猓蛊溆砂l(fā)夾型結(jié)構(gòu)變?yōu)閱捂溄Y(jié)構(gòu)， 單鏈DNA 引發(fā)掛鎖探針在T4 聚合酶下聚合形成雙鏈， 從而引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增放大反應(yīng)， 產(chǎn)生一條包含很多G-四分體結(jié)構(gòu)的DNA 長鏈， 捕獲大量的亞甲基藍(lán)分子， 亞甲基藍(lán)與電極表面間的擴(kuò)散速率減小，導(dǎo)致電流信號(hào)減弱。 當(dāng)有殺蟲劑時(shí)，殺蟲劑能抑制乙酰膽堿酶的活性， 因此不能引發(fā)接下來的滾環(huán)擴(kuò)增放大反應(yīng)， 大量自由的亞甲基藍(lán)可以擴(kuò)散到ITO 電極表面， 產(chǎn)生較大的電流響應(yīng)信號(hào)。 根據(jù)電流信號(hào)的變化，即可對(duì)殺蟲劑進(jìn)行定量檢測(cè)。 該傳感器能應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)中，為傳感器在環(huán)境及食品安全方面的監(jiān)測(cè)開辟了新的途徑。

圖6 擴(kuò)散介導(dǎo)的免固定均相電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)殺蟲劑的原理示意圖[31]Fig．6 Illustration of the pesticide detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[31]

2.2 親和介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器

除擴(kuò)散介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器外，研究者在電極表面修飾特殊的能吸附生物分子的分子層，利用生物分子與電極表面功能化修飾的表面分子之間的π-π 堆積等非共價(jià)鍵相互作用，發(fā)展了親和介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， 石墨烯六元碳環(huán)與單鏈DNA堿基中碳環(huán)結(jié)構(gòu)間的π-π 堆積相互作用使石墨烯對(duì)單鏈DNA 有著較強(qiáng)的親和力。 而DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)屏蔽核酸堿基， 因此石墨烯與DNA 雙鏈間的親和力很小。 李峰教授課題組結(jié)合石墨烯獨(dú)特的性質(zhì)和電化學(xué)傳導(dǎo)的高靈敏性， 構(gòu)建了π-π 堆積親和介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感平臺(tái)，對(duì)癌胚抗原（CEA）進(jìn)行了檢測(cè)[32]。 如圖7 所示，通過電化學(xué)還原在玻碳電極上修飾還原氧化石墨烯得到傳感器界面 （GCE/rGO）。 沒有目標(biāo)物CEA 時(shí)，體系中所有的DNA 以發(fā)夾型結(jié)構(gòu)（雙鏈結(jié)構(gòu)）存在，不能被吸附到電極表面。 而當(dāng)加入目標(biāo)物CEA 時(shí)，CEA 引發(fā)兩個(gè)發(fā)夾探針間的自組裝，使HP2 的5’末端變?yōu)槟鼙籘7Exo 酶識(shí)別的狀態(tài)，在酶的切割下，釋放出標(biāo)記有亞甲基藍(lán)的DNA 單鏈。 單鏈DNA 通過與還原氧化石墨烯間的π-π 堆積相互作用吸附到GCE/rGO 電極表面，產(chǎn)生放大的電化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)CEA 的高靈敏檢測(cè)。 這種基于親和介導(dǎo)的方式為均相電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建提供了新的途徑，并為癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)提供了新的思路。

圖7 親和介導(dǎo)的免固定均相電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)CEA 的原理示意圖[32]Fig．7 Illustration of the CEA detection by the affinity mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[32]

Li Wang 教授課題組在電極表面修飾十二烷基硫醇單層膜，利用十二烷基硫醇上烷基鏈與亞甲基藍(lán)之間的疏水作用，構(gòu)建了親和介導(dǎo)的均相電化學(xué)生物傳感器， 對(duì)目標(biāo)DNA 分子進(jìn)行了檢測(cè)[33]。 其工作原理如圖8 所示，將亞甲基藍(lán)標(biāo)記在發(fā)夾型DNA 探針上時(shí)，由于DNA 探針較大的分子尺寸和親水骨架， 標(biāo)記在發(fā)夾型DNA 探針上的亞甲基藍(lán)無法靠近電極表面。 當(dāng)加入目標(biāo)DNA 分子后，引發(fā)Exo III 對(duì)DNA 探針進(jìn)行循環(huán)剪切，得到尺寸較小的標(biāo)記有亞甲基藍(lán)的單核苷酸片段。 此時(shí)，標(biāo)記有亞甲基藍(lán)的單核苷酸片段通過與十二烷基硫醇上烷基鏈間的疏水作用被吸附到電極表面，得到放大的電流信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA 分子的檢測(cè)。 這種均相電化學(xué)生物傳感器為核酸的檢測(cè)提供了新的檢測(cè)平臺(tái)，不僅簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，還有利于靈敏度的提高。

圖8 親和介導(dǎo)的免固定均相電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)DNA 的原理示意圖[33]Fig．8 Illustration of the DNA detection by the affinity mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[33]

3 總結(jié)與展望

綜上所述，均相電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建主要通過電活性分子的擴(kuò)散介導(dǎo)或親和介導(dǎo)兩種方式實(shí)現(xiàn)。 由于均相電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建中， 不需要將生物識(shí)別元件固定到固體電極表面，因此避免了繁瑣耗時(shí)的固定化技術(shù)及其帶來的重現(xiàn)性差等問題，簡化了實(shí)驗(yàn)操作流程。 此外，由于均相電化學(xué)生物傳感器中涉及到的反應(yīng)發(fā)生在均相溶液中，從而提高了反應(yīng)效率，確保了傳感器的檢測(cè)性能。總體而言，均相電化學(xué)生物傳感技術(shù)為電化學(xué)生物傳感器的進(jìn)一步發(fā)展開辟了新的道路。但是，現(xiàn)有的均相電化學(xué)生物傳感器仍然存在一些亟待解決的問題：（1）均相電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計(jì)思路過于復(fù)雜， 反應(yīng)所需時(shí)間較長；（2）電活性信號(hào)分子過于單一，目前應(yīng)用于均相電化學(xué)生物傳感器中的信號(hào)分子只局限于亞甲基藍(lán)、二茂鐵和硫瑾等，由此導(dǎo)致輸出的信號(hào)也比較單一， 單一信號(hào)的輸出易受環(huán)境的影響，可能會(huì)給檢測(cè)結(jié)果帶來較大的影響。 因此，均相電化學(xué)生物傳感器仍然具有很大的發(fā)展前景。