基于二氧化鈦構(gòu)建鉛離子光電化學(xué)生物傳感器

安思雨， 吳 瑩， 李孟潔

（重慶科技學(xué)院建筑工程學(xué)院， 重慶401331）

0 前言

鉛離子(Pb2+)是一種普遍存在的且不可生物降解的劇毒污染物，它對(duì)生態(tài)和全球公眾健康已經(jīng)造成了嚴(yán)重的危害[1]。 大量研究表明，Pb2+可以通過空氣、 地表水以及土壤等途徑對(duì)人體的神經(jīng)、造血、心血管和內(nèi)分泌系統(tǒng)造成不利影響[2]。因此，高效、靈敏的檢測Pb2+對(duì)于環(huán)境的治理和疾病的早期診斷具有重要意義。 目前，許多分析方法被用于對(duì)Pb2+進(jìn)行定量檢測， 包括電化學(xué)分析法[3]、熒光分析法[4]、比色分析法[5]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[6]等，然而這些方法存在成本高、耗時(shí)長、靈敏度低、準(zhǔn)確度低以及穩(wěn)定性不好等問題。因此，人們迫切需要研發(fā)成本低、靈敏度高、穩(wěn)定性好、 準(zhǔn)確度高的檢測技術(shù)以滿足對(duì)Pb2+的定量分析， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)污染程度的監(jiān)測，進(jìn)一步為疾病的早期診斷提供科學(xué)依據(jù)。 光電化學(xué)(PEC) 分析是以修飾在電極上的光活性物質(zhì)為基礎(chǔ)，通過光照激發(fā)電極上光活性材料，最終由產(chǎn)生的電流強(qiáng)度確定待測目標(biāo)物含量的一種檢測方法[7]。 光電化學(xué)作為一種極具應(yīng)用前景的新興檢測技術(shù)， 采用了兩種信號(hào)完全分離的模式，從而顯著降低了背景信號(hào)干擾，獲得比傳統(tǒng)的檢測方法更好的穩(wěn)定性，更高的靈敏度及準(zhǔn)確性。 因此，受到了越來越多科研工作者的關(guān)注，在分析化學(xué)、 醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[8]。 迄今為止，PEC 生物傳感器已經(jīng)成功地檢測到了蛋白質(zhì)、 金屬離子、 細(xì)胞、microRNA 和DNA 等多種不同的目標(biāo)分析物，因此有望實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+高效、靈敏的檢測。

在光電化學(xué)分析過程中，PEC 生物傳感器的性能與其表面修飾的光電材料密切相關(guān)。 光電材料的光電轉(zhuǎn)化效率直接影響光電流的大小，進(jìn)而影響對(duì)目標(biāo)物檢測的靈敏度，故光電材料的選擇是構(gòu)建PEC 生物傳感器的核心要素之一。常用的光電材料包括無機(jī)半導(dǎo)體材料、有機(jī)半導(dǎo)體材料及其復(fù)合材料。 二氧化鈦(TiO2)、量子點(diǎn)(QDs)和硅(Si)等無機(jī)半導(dǎo)體材料因其獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)和催化性能被廣泛應(yīng)用于太陽能電池、光催化系統(tǒng)以及PEC 生物傳感器的構(gòu)建等[9]。在無機(jī)半導(dǎo)體材料中，TiO2因其優(yōu)異的光電性能而成為一種極具吸引力的典型材料。 眾所周知，TiO2是一種n 型半導(dǎo)體材料，具有成本低、無毒、化學(xué)穩(wěn)定性高、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。 通常，TiO2的帶隙為3．2 eV 且具有優(yōu)異的光電性能， 這歸因于其強(qiáng)大的紫外光吸附能力和較大的比表面積。 由于上述優(yōu)異的性能，TiO2在光催化、環(huán)境監(jiān)測、食品安全和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[10]。莫方靜等[11]開發(fā)了一種基于TiO2光電材料的PEC 適體傳感器，以實(shí)現(xiàn)凝血酶的靈敏檢測。阮沖等[12]采用了TiO2納米顆粒作為敏感元件通過催化發(fā)光(CTL)現(xiàn)象設(shè)計(jì)了測定乙酸甲酯的氣體傳感器。 受這些文獻(xiàn)報(bào)告的啟發(fā)，基于TiO2優(yōu)異的光電性能和PEC 傳感策略的優(yōu)勢，有望以TiO2作為基底修飾性材料構(gòu)建新型PEC 生物傳感器用于Pb2+的靈敏檢測。

該研究以重金屬離子Pb2+為檢測對(duì)象， 基于“signal off”模式，再結(jié)合光電性能優(yōu)異的基底材料TiO2，構(gòu)建了準(zhǔn)確度高、靈敏度高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)的PEC 生物傳感測試平臺(tái)(圖1)。 首先在玻碳電極(GCE)表面修飾光電材料TiO2，由于其良好的生物相容性、較大的比表面積和優(yōu)異的光電性能，可以觀察到很高的初始PEC 信號(hào)。 然后在上述電極上電沉積一層金納米粒子(Dep Au)，隨后通過Au-S 鍵將DNA 固載在電極表面，接著用1-己硫醇(HT)封閉電極表面的非特異性吸附位點(diǎn)。 最終，在Pb2+存在的情況下，Pb2+會(huì)與富含鳥嘌呤的DNA 結(jié)合，使其折疊形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，從而獲得顯著降低的PEC 信號(hào)。因此，通過記錄PEC 信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物Pb2+的靈敏檢測。在該工作中所構(gòu)建的PEC 生物傳感器靈敏度高、特異性好、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好，為Pb2+的檢測開辟了新的途徑，同時(shí)為檢測其他重金屬離子提供了新的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：CHI660E 電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)、TPEC10W 系列LED 光源(廣州彤泰科技有限公司)、KQ-5200DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、FA1004C 電子天平(上海市佑科儀器儀表有限公司)、JSM-7800F 掃描電子顯微鏡(SEM，日本JEOL 公司)、三電極體系：玻碳電極(Φ=4 mm)為工作電極、鉑電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極。

試劑： 鈦酸四丁酯(C16H36O4Ti)、 無水乙醇(CH3CH2OH)、 冰 醋 酸 (CH3COOH)、 氯 金 酸(HAuCl4)、1-己 硫 醇(HT)、過 氧 化 氫(H2O2)、Tris-HCl 緩沖溶液、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、氯化鉀(KCl)、氯化鈉(NaCl)、六水氯化鎂(MgCl2·6H2O)、無水氯化鈣(CaCl2)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)，采用M10UP分析超純水機(jī)制備超純水，用0．1 mol/L Na2HPO4、0．1 mol/L KH2PO4和0．1 mol/L KCl 混 合 制 備 了0．1 mol/L 磷 酸 鹽 緩 沖 溶 液 (PBS，pH=7．0)，DNA 由生工生物工程(上海)股份有限公司提供 ， 具 體 序 列 號(hào) 如 下 ：5＇ -SH -CTCTCTCTCTCTGGTTGGTGTGGTTGGACG-3＇

1.2 二氧化鈦的制備

將10 mL 鈦酸四丁酯加入到含有3．5 mL 無水乙醇的燒杯A 中并攪拌10 min。 同時(shí)， 將0．4 mL 冰醋酸和1 mL 超純水的混合溶液倒入含有3．5 mL 無水乙醇的燒杯B 中， 再滴加HCl 將pH調(diào)節(jié)至3。 隨后，將燒杯A 中的溶液以3 mL/min的速度滴入燒杯B 中，隨即攪拌30 min，再在40℃水浴中加熱2 h 以形成膠體溶液。 將膠體溶液在70 ℃下干燥，即可獲得二氧化鈦(TiO2)。 最終，將8 mg TiO2分散到1 mL 超純水中， 離心洗滌，通過連續(xù)超聲獲得均一的溶液， 并將其儲(chǔ)存在4℃下供進(jìn)一步使用。

1.3 PEC 生物傳感器的構(gòu)建

該文設(shè)計(jì)的PEC 生物傳感器的構(gòu)建過程如圖1 所示。 首先，玻碳電極(GCE)用氧化鋁(Al2O3)粉末在絨面革上反復(fù)拋光，在改性前用超純水清洗干凈。 然后， 將10 μL TiO2滴到上述清潔的GCE 表面上， 于37 ℃的烘箱中干燥以形成均勻的膜。接下來，將TiO2修飾的電極浸在1%的氯金酸溶液中，在-0．2 V 恒定電位下電化學(xué)沉積10 s獲得一層鍍金(Dep Au)的薄膜。 隨后，在該電極上滴加5 μL 2 μmol/L DNA 在4 ℃下孵育過夜，再滴加10 μL 0．1 mol/L HT 作為封閉劑， 并在室溫下培養(yǎng)40 min 以阻斷非特異性吸附位點(diǎn)。 最后，在電極上滴加10 μL 不同濃度的Pb2+， 室溫下放置40 min。

圖1 PEC 生物傳感器的制備過程示意圖Fig．1 Schematic diagram of the stepwise PEC biosensor construction process

1.4 PEC 測量

PEC 測量是在5 mL 0．1 mol/L PBS 緩沖溶液和0．1 mol/L H2O2的混合溶液中進(jìn)行， 其中H2O2是電子供體， 使用CHI 660E 電化學(xué)工作站記錄光電流-時(shí)間響應(yīng)曲線。 然后將波長為365～370 nm 的LED 燈作為激發(fā)光源，在0．0 V 電壓下關(guān)-開-關(guān)10-20-10 秒。

2 結(jié)果與討論

2.1 二氧化鈦的SEM 表征

圖2 是二氧化鈦的掃描電子顯微鏡(SEM)表征圖。 照樣結(jié)果顯示，制得的二氧化鈦成大小不均一的塊狀且具有較好的分散性，結(jié)果表明塊狀的二氧化鈦已經(jīng)成功制備。

圖2 二氧化鈦的SEM 表征Fig．2 SEM characterization of TiO2

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

由于H2O2的濃度和光輻照的波長都對(duì)光電流強(qiáng)度產(chǎn)生一定的影響，為了保證PEC 生物傳感器的良好分析性能，使電極具有最佳的光電流強(qiáng)度，因此進(jìn)行了一系列的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。從圖3A 可以看出在0．02 mol/L～0．10 mol/L H2O2濃度范圍內(nèi)，光電流隨其濃度的增大逐漸呈上升的趨勢。 但是， 當(dāng)H2O2濃度從0．10 mol/L 繼續(xù)增加至0．14 mol/L 時(shí)， 光電流隨其濃度的增大逐漸下降。 因此，該實(shí)驗(yàn)選擇0．10 mol/L 為H2O2的最佳濃度。圖3B 顯示出光電流在不同的激發(fā)波長下呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢。激發(fā)波長在515～525 nm（矩形d）之間時(shí)，未觀察到明顯的光電流。 混合白光(5000～5500 K)照射下(矩形e)可觀察到0．4 μA 的光電流信號(hào)。進(jìn)一步與混合白光照射下的光電流相比， 激發(fā)波長為395～405 nm(矩形b)和455～465 nm(矩形c)時(shí)，光電流分別增加到1．2 μA 和0．7 μA。 當(dāng)激發(fā)波長為365～370 nm(矩形a)時(shí)，可以觀察到最高的光電流(2．2 μA)。因此，選擇365～370 nm 用作該P(yáng)EC 生物傳感器檢測目標(biāo)的最佳激發(fā)波長。

圖3 檢測溶液中H2O2 濃度(A)和激發(fā)波長(B)對(duì)光電流的影響Fig．3 Effect of the H2O2 concentration in detection solution(A)and the irradiation wavelength(B)on the photocurrent

2.3 PEC 生物傳感器制備過程的PEC 表征

為了研究組裝的PEC 生物傳感器的可行性，在5 mL PBS 和50 μL H2O2的混合溶液中進(jìn)行測量并記錄了逐步修飾過程中的光電流。 如圖4 所示，與裸電極(曲線a)的光電流相比，經(jīng)光電性能優(yōu)異的TiO2修飾后的電極具有較高的光電流(曲線b)。在修飾電極上沉積金納米粒子(Au NPs)后，因?yàn)锳u NPs 的覆蓋使得TiO2表面的照明面積減小，光電流略有降低(曲線c)。 通過Au-S 鍵作用，將DNA 穩(wěn)定地固載到被修飾的電極表面， 光電流再次降低(曲線d)，經(jīng)HT 阻斷非特異性吸附位點(diǎn)，光電流進(jìn)一步降低(曲線e)。 最終，當(dāng)Pb2+存在時(shí)，單鏈DNA 和Pb2+會(huì)發(fā)生特異性配位，使其折疊形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而阻礙了電子轉(zhuǎn)移，光電流繼續(xù)降低(曲線f)。 這些結(jié)果表明該P(yáng)EC 生物傳感器已成功制備。

圖4 生物傳感器制備過程的PEC 表征:(a) 裸電極,(b) 二氧化鈦/裸電極,(c) 沉積金/二氧化鈦/裸電極,(d) 核酸適配體/沉積金/二氧化鈦/裸電極,(e)1-己硫醇/核酸適配體/沉積金/二氧化鈦/裸電極,(f) 鉛離子/1-己硫醇/核酸適配體/沉積金/二氧化鈦/裸電極Fig．4 PEC responses for each immobilized step:(a)bare GCE,(b)TiO2/GCE,(c)Au NPs/TiO2/GCE,(d)DNA/Au NPs/TiO2/GCE,(e)HT/DNA/Au NPs/TiO2/GCE and(f)Pb2+/HT/DNA/Au NPs/TiO2/GCE

2.4 PEC 生物傳感器制備過程的電化學(xué)表征

利用循環(huán)伏安法(CV)研究了所制備PEC 生物傳感器的修飾過程， 如圖5A 所示， 裸電極(GCE) 的CV 表征曲線顯示為一對(duì)對(duì)稱的氧化還原峰(曲線a)。 導(dǎo)電性能差的TiO2修飾在電極表面后，氧化還原峰值電流顯著降低(曲線b)。 由于Au NPs 良好的導(dǎo)電性促進(jìn)了電子轉(zhuǎn)移，所以當(dāng)在電極表面沉積Au NPs 后， 氧化還原峰電流增加(曲線c)。 隨著DNA 固載在電極表面后，DNA 在電極表面上形成的負(fù)電層對(duì)測試溶液中帶負(fù)電荷的鐵氰化物分子具有排斥作用，導(dǎo)致氧化還原峰值電流與曲線c 相比降低了(曲線d)。 接著用HT 阻斷非特異性吸附位點(diǎn)， 觀察到的氧化還原峰電流進(jìn)一步降低(曲線e)。 最后，當(dāng)Pb2+孵育在電極表面時(shí)，DNA 和Pb2+形成的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)阻礙了電子轉(zhuǎn)移，氧化還原峰電流再次降低(曲線f)。結(jié)果表明，該P(yáng)EC 生物傳感器的每一步修飾過程都是成功的。

圖5 生物傳感器制備過程的CV 表征(A)和EIS 表征(B):(a) 裸電極,(b) 二氧化鈦/裸電極,(c) 沉積金/二氧化鈦/裸電極,(d) 核酸適配體/沉積金/二氧化鈦/裸電極,(e)1-己硫醇/核酸適配體/沉積金/二氧化鈦/裸電極,(f) 鉛離子/1-己硫醇/核酸適配體/沉積金/二氧化鈦/裸電極Fig．5 CV(A)and EIS(B)responses for each immobilized step:(a)bare GCE,(b)TiO2/GCE,(c)Au NPs/TiO2/GCE,(d)DNA/Au NPs/TiO2/GCE,(e)HT/DNA/Au NPs/TiO2/GCE and(f)Pb2+/HT/DNA/Au NPs/TiO2/GCE

此外，還利用了電化學(xué)阻抗譜(EIS)技術(shù)進(jìn)一步研究該電極表面性質(zhì)。 一般，阻抗圖譜由一個(gè)半圓和一條直線組成，半圓的直徑相當(dāng)于電子轉(zhuǎn)移阻抗(Ret)，它反應(yīng)了氧化-還原探針在接近電極表面時(shí)受到的擴(kuò)散限制。 圖5B 是傳感器制備過程中不同修飾步驟的電化學(xué)阻抗譜，TiO2修飾在電極表面后，與電子轉(zhuǎn)移電阻(Ret)相關(guān)的半圓(曲線b)相比于裸電極(曲線a)的半圓顯著增加，表明半導(dǎo)體TiO2抑制了電子轉(zhuǎn)移。當(dāng)導(dǎo)電性能良好的Au NPs 沉積在電極表面時(shí)，Ret降低(曲線c)。隨著DNA 和HT 逐步修飾到電極表面后，由于電子轉(zhuǎn)移受阻，Ret依次增加(曲線d 和e)。 最終，孵育在電極表面的Pb2+與DNA 特異性配位形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)Ret的增加(曲線f)。以上結(jié)果再次證明PEC 生物傳感器的成功制備。

2.5 PEC 生物傳感器的性能分析

為研究所構(gòu)建的PEC 生物傳感器的檢測性能，在最優(yōu)的條件下對(duì)不同濃度Pb2+的PEC 響應(yīng)進(jìn)行了檢測。 如圖6A 所示， 隨著Pb2+濃度的增加，光電流呈現(xiàn)下降趨勢。 圖6B 呈現(xiàn)了Pb2+濃度對(duì)數(shù)與光電流之間的線性相關(guān)圖，其線性回歸方程為I=-0．159 lgc+1．47，相關(guān)系數(shù)r=0．993。 此外，該文構(gòu)建的PEC 生物傳感器的檢測性能與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的其他檢測Pb2+方法的檢測性能相比(表1)，該工作所構(gòu)建的傳感器具有更寬的線性范圍(500 fmol/L～500 nmol/L)和更低的檢測限(0．17 pmol/L)。 這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了所設(shè)計(jì)的生物傳感器對(duì)Pb2+的檢測具有高靈敏度和寬線性范圍， 為實(shí)際樣品中Pb2+的檢測提供了潛在的應(yīng)用途徑。

圖6 PEC 生物傳感器對(duì)不同濃度Pb2+的PEC 響應(yīng)圖(A)及校正曲線圖(B)(Pb2+的濃度分別為:500 fmol/L,5 pmol/L,50 pmol/L,500 pmol/L,5 nmol/L,50 nmol/L,500 nmol/L)Fig．6 PEC responses of different concentrations of target Pb2+(A)and the corresponding calibration curve(B)(the concentrations of target Pb2+were 500 fmol/L,5 pmol/L,50 pmol/L,500 pmol/L,5 nmol/L,50 nmol/L,500 nmol/L)

表1 PEC 生物傳感器同其他測定鉛離子的方法對(duì)比[3-6,13]Tab.1 The PEC biosensor compared with other Pb2+analytical methods

2.6 PEC 生物傳感器的穩(wěn)定性和選擇性

為了評(píng)估PEC 生物傳感器的穩(wěn)定性，在輻照波長為365～370 nm 的光照下，設(shè)置了9 個(gè)“關(guān)-開-關(guān)” 周期性循環(huán)對(duì)500 nmol/L Pb2+進(jìn)行檢測。從圖7A 中可以看出，光電流響應(yīng)基本維持不變，并且可以計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1．12%，這表明構(gòu)建的PEC 生物傳感器在檢測Pb2+時(shí)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。 此外， 還利用Mg2+、Na+、Ca2+、Hg2+、K+和空白溶液作為干擾物質(zhì)，對(duì)構(gòu)建的傳感器的選擇性進(jìn)行了研究。 如圖7B 所示， 當(dāng)500 nmol/L 干擾物孵育在被修飾的電極表面后可以觀察到強(qiáng)烈的光電流響應(yīng)，并且與空白對(duì)照獲得的光電流響應(yīng)幾乎相同。 然而，當(dāng)5 nmol/L Pb2+孵育在被修飾的電極表面后， 光電流響應(yīng)降低，并且明顯低于這五種干擾物質(zhì)。 顯然，這些結(jié)果表明了所構(gòu)建的PEC 生物傳感器對(duì)Pb2+的檢測表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性。

圖7 PEC 生物傳感器的穩(wěn)定性(A)及選擇性(B)Fig．7 Stability(A)and selectivity(B)of PEC biosensor

3 結(jié)論

綜上所述，該工作基于TiO2作為光電材料成功構(gòu)建了“signal off”模式的PEC 生物傳感器，并將其應(yīng)用于Pb2+的靈敏檢測。 正是因?yàn)門iO2具有獨(dú)特的光電特性， 獲得了較高的初始PEC 信號(hào)。利用Pb2+與DNA 特異性配位形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)阻礙了電子轉(zhuǎn)移， 導(dǎo)致PEC 信號(hào)顯著降低。該P(yáng)EC 生物傳感器制備簡單、檢測靈敏、穩(wěn)定性好、選擇性高，為Pb2+的測定提供了一種快速、準(zhǔn)確的檢測方案。 此外，該文構(gòu)建的PEC 生物傳感器也能擴(kuò)展到其他與環(huán)境相關(guān)的各種有毒重金屬離子的微量或痕量檢測，在環(huán)境監(jiān)測和醫(yī)療診斷中有著廣闊的發(fā)展前景和潛在的應(yīng)用價(jià)值。