云斑白條天牛腸道木質(zhì)素降解菌的分離與鑒定

段慧娟，方小英，朱林慧，李貝娜，彭思穎，楊振德

（廣西大學(xué)林學(xué)院 南寧市 530004）

木質(zhì)素是具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的高分子化合物，是由苯丙烷單元結(jié)構(gòu)通過醚鍵和碳碳鍵組成的具有三維空間結(jié)構(gòu)的無(wú)定型芳香類化合物，與纖維素和半纖維素構(gòu)成植物骨架的主要成分[1]。其不易降解，但含量豐富，占陸生植物干重15%～40%，是含量?jī)H次于纖維素的生物多聚體[2-3]。木質(zhì)素作為農(nóng)作物秸稈以及城市生活垃圾中常見的難降解物質(zhì)[4]，將其焚燒既產(chǎn)生資源浪費(fèi)，又造成環(huán)境破壞。同時(shí)，木質(zhì)素作為造紙業(yè)的副產(chǎn)物，由于難降解，如果直接排放環(huán)境中，會(huì)造成水生生態(tài)系統(tǒng)的破壞[5]。由于存在于細(xì)胞壁中的纖維素受到木質(zhì)素的保護(hù)，木質(zhì)素是否被有效降解對(duì)纖維素降解有著重要作用[3]。因此，開發(fā)高效降解木質(zhì)素的技術(shù)成為木質(zhì)纖維素資源化利用與環(huán)境保護(hù)的重要問題。

目前木質(zhì)素降解方法主要為物理法、化學(xué)法和生物法。微生物降解法具有反應(yīng)條件溫和、成本低、環(huán)境友好等特點(diǎn)[6]，成為國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。其原理為降解木質(zhì)素的微生物通過氧化斷裂木質(zhì)素側(cè)鏈Cα-Cβ鏈，徹底降解產(chǎn)物主要是CO2和H2O[7]。目前研究木質(zhì)素降解菌株中主要以真菌、細(xì)菌為主，真菌中白腐菌對(duì)木質(zhì)素具有強(qiáng)的降解能力，受到廣泛關(guān)注[6]。然而細(xì)菌具有適應(yīng)性強(qiáng)、來源廣，更易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景。細(xì)菌通過產(chǎn)酶對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行降解，主要包括3種酶：漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶與錳過氧化物酶。每個(gè)漆酶蛋白分子含有4個(gè)銅原子，是漆酶催化反應(yīng)的活性中心[8]。范晶晶等[9]研究發(fā)現(xiàn)金屬銅離子和錳離子在合適的濃度能刺激產(chǎn)漆酶，酶活性最高可達(dá)263.44 U/L。木質(zhì)素過氧化物酶主要來源于真菌，在細(xì)菌中如鏈霉菌（Streptomycescinnamomensis）能夠分泌過氧化物酶降解木質(zhì)素，但活性較低。Jing等[10]通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成使過氧化物酶活性得到大幅度提升。

昆蟲對(duì)地球上所有可利用的物質(zhì)資源幾乎都可以分解，如天牛幼蟲蛀食木材，其腸道微生物處于常溫中性條件下可對(duì)木材消化降解[11]。本研究以云斑白條天牛〔Batocera lineaolata（Chaevroat）〕為研究對(duì)象，利用愈創(chuàng)木酚選擇性培養(yǎng)基和苯胺藍(lán)平板法，初步篩選其腸道內(nèi)具有木質(zhì)素降解功能的菌株，以期為木質(zhì)素降解菌株資源的開發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和培養(yǎng)基

樣品為云斑白條天牛4齡幼蟲，于2018年5月上旬至6月上旬采集于廣西國(guó)有高峰林場(chǎng)六里分場(chǎng)（108°20′E，22°58′N）的桉樹林。

愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基[12]：愈創(chuàng)木酚1.0 g，酒石酸銨0.1 g，蛋白胨2.6 g，MnSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，Na2HPO40.2g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，121℃高壓滅菌20 min。

苯胺藍(lán)培養(yǎng)基[12]：苯胺藍(lán)0.1 g溶于10 mL蒸餾水，酵母膏10 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至990 mL，分開121℃高壓滅菌20 min。

1.2 木質(zhì)素降解菌的初篩

選取3頭云斑白條天牛4齡幼蟲，用酒精沖洗并浸泡3 min進(jìn)行表面消毒。用無(wú)菌水沖洗3次。在垂直超凈工作臺(tái)上，用解剖針、解剖剪、鑷子解剖取出腸道，將腸道上的脂肪等物質(zhì)用無(wú)菌水沖走后放入玻璃勻漿器，加入1 mL無(wú)菌水進(jìn)行研磨，制成腸道勻漿液。用高速冷凍離心機(jī)以5 000 r/min離心5 min。

取稀釋103、104、105倍的勻漿稀釋液各100μL均勻涂布在愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 d。，待菌落長(zhǎng)出后，用接種環(huán)從每種稀釋梯度的培養(yǎng)基上挑取大小、形態(tài)、顏色有差異的單菌落，在新的愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基上劃線分離4～5次，直至得到單一純菌落。選擇培養(yǎng)基以愈創(chuàng)木酚為唯一碳源，因此，可在該選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落即可初步確定為具有降解木質(zhì)素能力的細(xì)菌。

1.3 木質(zhì)素降解菌的復(fù)篩

將獲得的各個(gè)純培養(yǎng)菌株用接種環(huán)點(diǎn)種在苯胺藍(lán)培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱30℃倒置培養(yǎng)2 d后，出現(xiàn)透明水解圈，用游標(biāo)卡尺測(cè)量水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），進(jìn)行3次重復(fù)取平均值，計(jì)算水解圈和菌落直徑比值（D/d），選擇D/d值大的菌株即為降解木質(zhì)素能力強(qiáng)的菌株。

1.4 木質(zhì)素降解菌的鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)觀察根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]對(duì)分離所得的菌株進(jìn)行菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色反應(yīng)測(cè)定。

1.4.2 菌株16SrDNA基因測(cè)序

將在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d的菌株接種到液體愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)48 h后，取細(xì)菌懸液2 mL，11 500 r離心1 min，倒去上清液。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根DP302），按其說明書提取供試菌株的總DNA，用Nanodrop 2 000可見分光光度計(jì)測(cè)定所提取DNA的OD260/OD280比值，確定DNA純度和濃度，在DYY-8C電泳儀上用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA是否有降解現(xiàn)象。采用王蕊蕊等[15]的方法，以提取的總DNA為模板，利用細(xì)菌16SrDNA的通用引物：正向引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 反向 引物1 492 R（5’-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：12.5μL Eay Taq PCR SuperMix（+dye），1.0μL 27F（10 mmol/L）和1.0μL 1 492 R（10 mmol/L），1.0μL DNA模 板（50 ng/μL）12.5μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃10 min終末延伸；4℃條件下保存。反應(yīng)完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合格后委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。在NCBI平臺(tái)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上將測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行Nucleotide BLAST序列比對(duì)，并用MEGA 7.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌屬分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)

在愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基上共篩選出37株細(xì)菌菌株，其中，B01和B12菌株在苯胺藍(lán)平板上水解圈直徑（D）分別為0.95 cm和0.80 cm，菌株菌落直徑分別為0.60 cm和0.50 cm，D/d值分別為1.60和1.58，比值最大（圖1）。其中菌株B01在愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上為白色，表面光滑，邊緣規(guī)則，單菌落呈現(xiàn)圓形，中間顏色較邊緣深，不透明。革蘭氏染色呈現(xiàn)紅色，桿狀，可以判定菌株B01為革蘭氏陰性菌。菌株B12在培養(yǎng)基上為白色，表面光滑，邊緣規(guī)則，單菌落呈現(xiàn)圓形，中間凸起，不透明，革蘭氏染色呈現(xiàn)紅色，球狀，判定為革蘭氏陰性菌。

圖1 菌株B01和B12在愈創(chuàng)木酚選擇培養(yǎng)基上的菌落特征及在苯胺藍(lán)培養(yǎng)基上的水解圈

2.2 菌株的16S rDNA序列分析

提取菌株B01和菌株B12的DNA之后，通過細(xì)菌通用引物27F-1 492 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，所得基因片段如圖2所示，條帶明亮清晰，均在1 500 bp左右。

圖2 菌株B01和B12的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

據(jù)測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行分析比對(duì)，選取BLAST中相似度較高的細(xì)菌序列，并下載相關(guān)序列后，利用MEGA7.0軟件的NeighborJoining法構(gòu)建細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，菌株B01和Pseudo?monasbaetica（NR 116 899.1）在同一分支上，因此，將該菌初步判斷為假單胞菌屬；菌株B02和Kosako?nia arachidis（NR 116 403.1）在同一分支上，因此，將該菌初步判斷為考氏科薩克氏菌屬。

圖3 菌株B01和B12的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

細(xì)菌具有良好的環(huán)境適應(yīng)性與豐富的生物多樣性，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫等環(huán)境下可以生存，在降解木質(zhì)素上具有很好的發(fā)展?jié)摿16]。近些年來，細(xì)菌降解木質(zhì)素的研究受到越來越多的關(guān)注。降解木質(zhì)素的細(xì)菌主要有厭氧梭菌屬（Clostridium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、雙芽孢桿菌屬（Amphiba?cillus）、微球菌屬（Micrococcus）等[17]。木質(zhì)素降解酶系非常復(fù)雜，其完整的代謝途徑與降解機(jī)理尚未明確[16]，代謝途徑研究較為明確的主要是以鞘氨醇單胞菌SYK-6為研究對(duì)象構(gòu)建的代謝途徑[17]。細(xì)菌降解木質(zhì)素獲得大量有用代謝產(chǎn)物，如生物乙醇、生物柴油、沼氣、氫氣等新能源物質(zhì)[18]。因此，研究新的木質(zhì)素降解菌資源，對(duì)環(huán)境保護(hù)、資源利用等具有重要意義。

本研究從云斑天牛腸道內(nèi)分離獲得具有降解木質(zhì)素能力的細(xì)菌菌株2個(gè)，分別屬于假單胞菌屬和考氏科薩克氏菌屬。假單胞菌屬屬于變形菌門（Proteobacteria）假單胞菌科（Pseudomonadaceae）的細(xì)菌，考氏科薩克氏菌屬屬于變形菌門（Proteobacteria）腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的細(xì)菌。假單胞菌屬是木質(zhì)素最有效降解者[19]，為油污土壤微生物中的優(yōu)勢(shì)菌屬[20]，作為非絲狀細(xì)菌可降解木質(zhì)纖維素低分子量部分以及木質(zhì)纖維素的降級(jí)產(chǎn)物[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬生長(zhǎng)溫度范圍較廣，在4℃～43℃均可生長(zhǎng)，其多數(shù)最適生長(zhǎng)溫度為30℃，在pH值為7.0～8.5之間生長(zhǎng)，生長(zhǎng)范圍較小[22]。假單胞菌屬與其他細(xì)菌組成復(fù)合菌群可進(jìn)一步提高木質(zhì)素降解速率[23]，Ca2+、Mn2+和Fe3+對(duì)熒光假單胞菌GcM5--1A胞外木質(zhì)素過氧化物酶活力有較強(qiáng)的促進(jìn)作用[24]。

目前關(guān)于考氏科薩克氏菌屬木質(zhì)素降解研究較少，未建華[25]從黃翅大白蟻（Macrotermesbarneyi）腸道固氮微生物中分離得到Kosakonia屬，其大多為固氮菌[26]。李鋒[27]以堿木質(zhì)素為唯一碳源，從白蟻（Termite）腸道中分離出Kosakonia屬。木質(zhì)素降解酶的合成與活性的強(qiáng)弱受培養(yǎng)基環(huán)境的pH影響較大[28]。傅慧靜等[28]發(fā)現(xiàn)松墨天牛（Monochamusalter?natus）腸道中的黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）處于偏酸性環(huán)境中過氧化物酶活性較強(qiáng)，陳建軍等[29]研究發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌（Phanerochaetechrys?osporium）的漆酶在pH=4時(shí)活性較大，可見酸性條件對(duì)酶的活性也有較大影響。

本研究從云斑天牛腸道細(xì)菌中分離出考氏科薩克氏菌屬，豐富了木質(zhì)素降解菌株資源，為云斑天牛腸道微生物進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。下一步將對(duì)假單胞菌屬和考氏科薩克氏菌屬降解木質(zhì)素的微觀過程、降解機(jī)理以及菌株的產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的工業(yè)化生產(chǎn)條件等方面開展深入研究。