頂空-氣質(zhì)聯(lián)用比較不同產(chǎn)地金銀花與山銀花揮發(fā)性成分差異

郭慧玲，羅江南，熊耀坤，胡律江，徐夢(mèng)甜，封傳華，趙曉娟，劉欣（江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330004）

金銀花（Lonicerae japonicaeflos，L.japonicaeflos）為忍冬科植物忍冬（LonicerajaponicaThunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，山銀花（Loniceraeflos，L.flos）為忍冬科植物灰氈毛忍冬（LoniceramacranthoidesHand.Mazz.）、紅腺忍冬（LonicerahypoglaucaMiq.）、華南忍冬（LoniceraconfusaDC.）或黃褐毛忍冬（LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或帶初開的花，均具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，主要用于溫病發(fā)熱、喉痹、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等病癥[1]。金銀花和山銀花中均含有揮發(fā)油類成分。目前已從金銀花中發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)油成分多達(dá)390種，其揮發(fā)油成分復(fù)雜多樣，主要含有棕櫚酸、亞油酸、二十九烷、十四酸甲酯等[2-8]；山銀花揮發(fā)油類主要有芳樟醇、棕櫚酸、亞油酸以及辛烯醇等[9-13]。目前使用頂空氣相色譜分析測(cè)定金銀花和山銀花揮發(fā)性成分并進(jìn)行比較的文獻(xiàn)不多，基于揮發(fā)性成分可能和兩者疏風(fēng)散熱功能主治有關(guān)聯(lián)，因此，研究兩者揮發(fā)油類成分的差異具有較大意義。

本試驗(yàn)采用頂空進(jìn)樣方法，分析金銀花和山銀花樣品粉末，使用GC-MS對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分離和鑒別[14]。比較金銀花和山銀花揮發(fā)性成分的含量與種類的差異，并結(jié)合聚類分析，對(duì)不同產(chǎn)區(qū)的金銀花和山銀花進(jìn)行區(qū)分，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

Agilent 7697A自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、7890A 型氣相色譜儀、5975C單四極桿質(zhì)譜儀（安捷倫公司，美國）；Sartorius BT 224S萬分之一天平。

山銀花3批，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鄧可眾副教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬的干燥花蕾或帶初開的花；金銀花8批（購于樟樹市慶仁中藥飲片有限公司），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鄧可眾副教授鑒定為金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花。產(chǎn)地及批號(hào)見表1。

表1 不同產(chǎn)地金銀花與山銀花藥品信息Tab 1 Lonicerae japonicae flos and Lonicerae flos medicine information from different origins

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 GC條件 色譜柱：HP-5 毛細(xì)管柱型彈性色譜柱（0.25 μm×250 μm×30 m）；進(jìn)樣口：230℃；載氣：氦氣；恒流模式，流速：1 mL·min－1；分流比：50∶1；程序升溫：初始40℃，維持5 min，5℃·min－1升至 60℃，3℃·min－1升至100℃，4℃·min－1升至250℃，維持2 min。

2.1.2 MS條件 電離方式：EI源；燈絲電流30 μL；離子源：230℃；接口：250℃；掃描范圍50～550 amu。

2.1.3 頂空進(jìn)樣條件 分別精密稱取各金銀花和山銀花藥材粉末200 mg，裝于20 mL頂空瓶中置于樣品盤上。爐溫150℃，針溫165℃，傳輸線溫度180℃，樣品瓶保溫時(shí)間15 min。

2.2 GC-MS檢測(cè)結(jié)果

按“2.1”項(xiàng)下GC-MS條件測(cè)定樣品揮發(fā)性成分含量，通過譜庫NIST17.L檢索，結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)化合物進(jìn)行分析，總離子流圖見圖1和圖2，共有化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)見表2和圖3，采用面積歸一化法測(cè)定其相對(duì)百分含量，結(jié)果見表3。

表2 共有峰化學(xué)成分Tab 2 Chemical component of the common peak

表3 不同產(chǎn)地金銀花與山銀花揮發(fā)性成分相對(duì)百分含量(%)Tab 3 Relative percentage of volatile components in Lonicerae japonicae flos and Lonicerae flos from different areas (%)

續(xù)表3

圖1 山銀花揮發(fā)性成分總離子流圖Fig 1 Total ion current diagram of volatile components of Lonicerae flos

圖2 金銀花揮發(fā)性成分總離子流圖Fig 2 Total ion current diagram of volatile components of Lonicerae japonicae flos

圖3 金銀花和山銀花共有峰質(zhì)譜圖及可能結(jié)構(gòu)Fig 3 Mass-spectrogram and structure of common peaks of Lonicerae japonicae flos and Lonicerae flos

共鑒定出86個(gè)化合物，其中共有成分8個(gè)，即糠醛、糠醇、苦杏仁油、二甘醇、2-吡咯-甲醛、苯乙醇、4H-吡喃-4-酮、γ-丁內(nèi)酯，其中二甘醇相對(duì)含量最高（30.30%），其次為4H-吡喃-4-酮（18.57%）。不同產(chǎn)地山銀花和金銀花均存在特有成分。

山銀花中S1、S2、S3分別鑒定出20、24、27個(gè)成分，其中S1以二甘醇（30.30%）、糠醛（6.95%）、糠醇（15.89%）、4H-吡喃-4-酮（18.57%）含量較高，吡咯（1.22%）、甲基吡嗪（1.27%）為其特有成分；S2以（3R，6S）-2，2，6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-吡喃-3-醇（58.34%）、糠醛（5.37%）含量較高，二氫獼猴桃內(nèi)酯（0.22%）、3，7-二甲基-1，5，7-辛三烯-3-醇（2.30%）、芳樟醇（1.97%）等成分為其特有成分；S3以二甘醇（21.72%）、糠醛（7.99%）、糠醇（7.89%）、4H-吡喃-4-酮（19.60%）、2，3-丁二醇（6.46%）含量較高，環(huán)丙基甲酮（0.51%）、1，4-丁烯二醇（0.38%）、對(duì)乙烯基愈創(chuàng)木酚（1.35%）、吡嗪酰胺（0.80%）為其特有成分。

金銀花S4～S11樣品分別鑒定出32、26、36、40、25、32、29、27個(gè)成分，8批金銀花中均以二甘醇、糠醛、糠醇、4H-吡喃-4-酮含量較高。S4以羊脂酸（1.06%）、羊油酸（1.18%）等為其特有成分，S5以11-癸基-二十二烷（8.76%）為其特有成分，S6中特有成分包括喹啉（0.26%）、N，N-二-苯甲酰氧基-環(huán)丁烷-1，1-二甲酰胺（0.53%）、甲基環(huán)戊烯醇酮（0.27%）、1、2-氨基吡啶（0.27%）、吡嗪（0.38%）、14-甲基-十五烷酸甲基酯（1.04%），S7以（Z，Z）-1，3-環(huán)辛二烯（0.34%）、2-戊炔-1-醇（0.95%）、辛醛（0.44%）、7，10-十八碳二烯酸甲基酯（0.36%）、戊醛（2.10%）為其特有成分，S8中特有成分有甘油（0.51%）和環(huán)庚二烯酮（0.56%），S9中特有成分為甲基丙烯醛（1.11%）、E-2-庚烯醛（0.89%）、1-碘-三十烷（3.78%）、N-氧代吡啶（1.13%），S10以（2S，3S）-（＋）-2，3-丁二醇（1.69%）、2-乙基-3-乙烯基噁丙環(huán)（0.89%）、1，3，6-庚三烯（0.27%）為其特有成分，S11中特有成分分別為2-丙烯基-肼（0.58%）、二磷酸二異辛基酯（0.78%）、2，6-二（1，1-二甲基乙基）-4-甲基苯酚甲基氨基甲酸酯（0.45%）。

2.3 揮發(fā)性成分種類及相對(duì)含量

金銀花和山銀花中揮發(fā)性成分主要為脂肪族化合物，芳香族化合物和雜環(huán)化合物占有一定比例。脂肪族化合物包括酸類、酯類、醇類、酮類、醛類及烴類，共檢測(cè)出4種酸類化合物，10種酯類化合物，9種醇類化合物，12種酮類化合物，8種醛類化合物，7種烴類化合物，6種芳香族化合物，其他主要為雜環(huán)、含氮等化合物；醇類化合物的相對(duì)含量最高（38.32%～71.13%），其次為酮類和醛類化合物（23.66%和13.74%），結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地金銀花與山銀花中揮發(fā)性成分種類及相對(duì)含量(%)Tab 4 Type and relative content of volatile components in Lonicerae japonicae flos and Lonicerae flos from different areas (%)

金銀花和山銀花中揮發(fā)性成分種類及相對(duì)含量上有差異。金銀花中酸類化合物種類較多，山銀花中僅一個(gè)樣品檢測(cè)到棕櫚酸，且其含量較低。金銀花中酯類化合物種類及相對(duì)含量均高于山銀花。山銀花中醇類化合物數(shù)量較多，其中芳樟醇、辛烯醇在金銀花中未被檢測(cè)到，二甘醇含量以山銀花較高。金銀花中酮類化合物種類較多，山銀花中則少數(shù)酮類含量高于金銀花。烴類和芳香族化合物主要存在于金銀花中，種類多于山銀花；含量上金銀花中烴類較高，山銀花中則芳香族化合物較高。

2.4 聚類分析

以11批樣品共有成分相對(duì)百分含量為基準(zhǔn)，采用組間聯(lián)結(jié)的方式，以平方Euclidean距離為測(cè)度，對(duì)不同產(chǎn)地金銀花和山銀花進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，得到聚類樹狀圖（見圖4）?？芍?，當(dāng)類間距為5時(shí)，可將11批金銀花和山銀花樣品分為4類，S2分為第Ⅰ類，S9和S11分為第Ⅱ類，S1分為第Ⅲ類，S3、S4、S5、S6、S7、S8、S10分為第Ⅳ類。11批樣品中，第Ⅰ類S2中各個(gè)成分含量均低于其他樣品，差異較大，故S2為一類；第Ⅱ類聚集了S9和S11，兩個(gè)樣品的二甘醇含量分別為41.97%和43.87%，含量遠(yuǎn)高于其他樣品，其他成分含量相近，故聚為一類；第Ⅲ類為S1，其糖醇、吡咯-2-甲醛、苯乙醇、4H-吡喃-4-酮的含量較其他10批樣品高，故分為一類；第Ⅳ類聚集了S3、S7、S10、S4、S5、S6、S8，S7和S10中二甘醇和4H-吡喃-4-酮的含量與S9和S11差異較大，S3中苦杏仁油含量最高，但與其他樣品含量差異不明顯，其他成分含量與其他樣品含量差異不明顯，故聚為一類。

圖4 不同產(chǎn)地金銀花和山銀花聚類分析Fig 4 Cluster analysis of Lonicerae japonicae flos and Lonicerae flos from different area

3 討論

3.1 條件優(yōu)化

對(duì)樣品質(zhì)量、頂空溫度、保溫時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化?？疾?00、150、200、250、300、500 mg頂空裝樣量對(duì)分離的影響，發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣200 mg的分離效果比其他質(zhì)量分離效果較好，色譜較全且穩(wěn)定，質(zhì)量過小或過大時(shí)，易造成頂空預(yù)熱不均勻或粉末層太厚揮發(fā)性成分不易揮發(fā)?？疾?0、90、120、150、180℃頂空溫度對(duì)分離的影響，發(fā)現(xiàn)在150℃時(shí)，揮發(fā)性成分的數(shù)量達(dá)到最高，當(dāng)溫度過低時(shí)，揮發(fā)性成分無法揮發(fā)出來進(jìn)入檢測(cè)器；但溫度過高時(shí)，部分揮發(fā)性成分發(fā)生熱降解?？疾鞓悠繁貢r(shí)間5、10、15、20、25 min對(duì)分離的影響，當(dāng)保溫時(shí)間為15 min時(shí)，分離效果較好。對(duì)色譜程序升溫條件進(jìn)行了調(diào)整，得出最佳色譜條件。

3.2 山銀花與金銀花揮發(fā)性成分的差異

不同產(chǎn)地金銀花和山銀花揮發(fā)性成分的種類及含量存在差異，共有成分的相對(duì)含量也不同。金銀花中的酸類、酯類、酮類、烴類、芳香族化合物及其他類成分的種類均高于山銀花，醇類物質(zhì)則山銀花中種類更多；金銀花中的酯類、酸類、烴類在含量上高于山銀花，醇類、酮類、芳香族化合物則低于山銀花；金銀花中特有成分的種類及數(shù)量均高于山銀花。

棕櫚酸、煙酸甲酯、棕櫚酸甲酯普遍存在于金銀花中，棕櫚酸是已知的具有較強(qiáng)生物活性的物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抑菌[15]、抗氧化[16]、抗細(xì)胞凋亡作用[17]；棕櫚酸甲酯被稱為天然保護(hù)劑，對(duì)異丙腎上腺素引起的心肌損傷具有保護(hù)作用[18]，且可作為佐劑增加索拉非尼的抗腫瘤作用[19]。

結(jié)合聚類分析對(duì)金銀花和山銀花進(jìn)行分類，將不同產(chǎn)地的金銀花和山銀花進(jìn)行了區(qū)分。結(jié)果河南金銀花被歸為一類，表明河南金銀花揮發(fā)油含量總體上差異不大，由于采摘時(shí)間不同，可能導(dǎo)致其個(gè)別成分上的差異，金銀花揮發(fā)性成分總體上要優(yōu)于山銀花。金銀花和山銀花中揮發(fā)性成分種類及數(shù)量均有較大的差異，表明不同產(chǎn)地、不同年份和不同采收時(shí)間均有可能對(duì)藥材的成分產(chǎn)生影響，河南為金銀花的道地產(chǎn)區(qū)，表明河南的生態(tài)環(huán)境更適合于金銀花的生長。

中醫(yī)應(yīng)用芳香性藥材時(shí)，是“取其氣而不取其味”，“取其氣”即利用藥材中揮發(fā)性有效成分用于治療疾病，金銀花和山銀花中含有揮發(fā)性成分，其揮發(fā)性成分是否具有藥效作用，是否與功能主治中的“疏風(fēng)散熱”有關(guān)聯(lián)，這也是后續(xù)研究的主要方向。鑒于本研究中各個(gè)產(chǎn)區(qū)樣本數(shù)較少，在后續(xù)研究中還需繼續(xù)增加采集地區(qū)與樣品批次，進(jìn)一步完善金銀花和山銀花的鑒別研究，為金銀花和山銀花的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)與參考。