基于UPLC多指標(biāo)成分含量測(cè)定的柴胡不同部位質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

周麗娟，孫欣光*，王雅芝，3，王玉龍，楊曉寧*（.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京 00085；.山西振東道地藥材開發(fā)有限公司，山西 長治 04700；3.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 遵義 563000）

柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumwilld.的干燥根，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣等功效[1]。研究表明，柴胡具有解熱、抗炎、抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2-4]。柴胡中主要含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油、多糖等成分[2，5-6]，其中柴胡皂苷為其主要活性成分，也是目前評(píng)價(jià)柴胡質(zhì)量的主要指標(biāo)成分[4]。柴胡具有顯著的臨床療效而被廣泛使用，含柴胡的中成藥品種約500個(gè)[7]，《中國藥典》2015年版及增補(bǔ)版收載含柴胡中成藥品種共105個(gè)，常見品種有柴黃片、柴胡疏肝丸、小柴胡泡騰片、小柴胡顆粒、柴胡疏肝丸等[8]。

由于柴胡藥材的市場需求量較大，導(dǎo)致柴胡藥材資源短缺，曾出現(xiàn)供不應(yīng)求的局面。目前柴胡藥材野生資源很少，市場上流通的柴胡藥材以栽培品種為主，且大多會(huì)保留部分地上殘莖。柴胡的藥用部位為根，文獻(xiàn)報(bào)道柴胡莖葉與根的化學(xué)成分存在差異[6]，但關(guān)于地上殘莖的化學(xué)成分研究鮮有報(bào)道，地上殘莖與根之間主要柴胡皂苷類成分的含量差異情況不明確，從而導(dǎo)致市場流通的柴胡藥材質(zhì)量參差不齊，影響其療效。

多指標(biāo)的含量測(cè)定來評(píng)價(jià)柴胡藥材質(zhì)量的研究已有報(bào)道，但所需對(duì)照品用量大，價(jià)格昂貴且難以獲得。一測(cè)多評(píng)（quantitative analysis of multi-components by single-maker，QAMS）以中藥中某一種成分對(duì)照品為內(nèi)參物，利用相對(duì)校正因子實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)成分的同時(shí)測(cè)定，可以很好地解決這類難題[9-14]，被《中國藥典》收載用于多種中藥的多成分含量測(cè)定及質(zhì)量評(píng)價(jià)，具有重要的指導(dǎo)意義[15]。

本研究建立QAMS法同時(shí)測(cè)定柴胡藥材根和地上殘莖中6種柴胡皂苷成分的含量，以柴胡皂苷d為內(nèi)參物，建立其與柴胡皂苷a、b2、c、e和f的相對(duì)校正因子，并計(jì)算5種柴胡皂苷的含量；采用外標(biāo)法（ESM）驗(yàn)證QAMS的可行性和準(zhǔn)確性，最終建立QAMS法測(cè)定柴胡藥材中6 種主要皂苷成分的含量，并測(cè)定 8批柴胡藥材根及殘莖不同分段部位中6種成分的含量，比較各柴胡皂苷成分差異，闡明地上殘莖對(duì)柴胡藥材質(zhì)量的影響，為柴胡藥材的質(zhì)量控制提供新的方法和依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

柴胡皂苷a（批號(hào)：110777-201912，含量：94.8%）、柴胡皂苷d（批號(hào)：110778-201912，含量：96.3%）（中國食品藥品檢定研究院）；柴胡皂苷b2（批號(hào)：7383，含量：99.6%）、柴胡皂苷c（批號(hào)：4237，含量：100%）、柴胡皂苷e（批號(hào)：4157，含量：99.9%，）、柴胡皂苷f（批號(hào)：6131，含量：99.7%）（施丹德生物科技有限公司）；色譜乙腈（批號(hào)：JB091230，默克）；色譜甲醇（批號(hào)：5021403，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆话彼ㄅ?hào)：20200302，福晨化學(xué)試劑有限公司）；純水（Milli-Q 制備）。

1.2 藥材

不同產(chǎn)地的柴胡藥材，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)高建平教授鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根及少量地上殘留莖，其產(chǎn)地來源信息見表1，均購自安國藥材市場。帶有地上殘莖的柴胡藥材從蘆頭處分開，分為根和殘莖兩部分；殘莖從蘆頭處開始分為莖0～1 cm（J1）、莖1～2 cm（J2）、莖2 cm以上（J3）三部分，根從蘆頭處開始分為根0～1 cm（G1）、根1～2 cm（G2）、根2 cm以下（G3）三部分。

表1 柴胡藥材樣品來源信息表Tab 1 Source information of Bupleuri Radix

1.3 儀器

Waters Acquity UPLC H-Class 系統(tǒng)（PDA 檢測(cè)器，Waters 公司）；色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；TLE204/02電子天平、XSE205DU電子天平（METTLER TOLEDO）；電子天平（MSA36S-OCE-DH，Sartorius）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～1 min，5%A；1～2 min，5%→30%A；2～5 min，30%→32%A；5～8 min，32%→35%A；8～12 min，35%→40%A；12～15 min，40%→45%A；15～20 min，45%A）；流速0.45 mL·min－1；柱溫40℃，進(jìn)樣量3 μL，檢測(cè)波長為205 nm（柴胡皂苷a、c、d、e、f）和254 nm（柴胡皂苷b2）。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f對(duì)照品適量，分別精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷a 0.20 mg、柴胡皂苷b20.0075 mg、柴胡皂苷c 0.08 mg、柴胡皂苷d 0.30 mg、柴胡皂苷e 0.020 mg、柴胡皂苷f 0.05 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取柴胡藥材粉末（過3號(hào)篩），約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加含5%氨水的甲醇25 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，用含5%氨水的甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取空白溶液（含5%氨水的甲醇）、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示空白溶液在與混合對(duì)照品溶液和供試品溶液相應(yīng)位置沒有色譜峰，表明空白溶液對(duì)6種皂苷成分的檢測(cè)無干擾，方法專屬性良好，見圖1。

圖1 柴胡6種皂苷的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of 6 saikosaponins in Bupleuri Radix

2.4.2 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限考察 取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)，以柴胡皂苷進(jìn)樣量（x）與峰面積（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比S/N為 3∶1時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限和S/N為10∶1時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限，結(jié)果見表2。

表2 線性范圍Tab 2 Linearity

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f 的峰面積RSD（n＝6），結(jié)果對(duì)照品溶液RSD分別是0.39%、0.13%、0.61%、0.14%、1.5%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)藥材，精密稱定6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得含柴胡皂苷a 6.29 mg·g－1、柴胡皂苷b20.0933 mg·g－1、柴胡皂苷c 1.94 mg·g－1、柴胡皂苷d 7.86 mg·g－1、柴胡皂苷e 0.639 mg·g－1、柴胡皂苷f 1.42 mg·g－1，RSD分別為0.50%、0.43%、0.89%、0.71%、1.8%、1.4%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液分別在0、4、8、12、18、24、48 h 按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f峰面積的RSD，結(jié)果為2.1%、1.7%、2.0%、1.6%、2.2%、2.6%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f對(duì)照品，精密稱定，加含5%濃氨溶液的甲醇溶解，配制成每1 mL含柴胡皂苷a 0.1204 mg、柴胡皂苷b20.0018 mg、柴胡皂苷c 0.0398 mg、柴胡皂苷d 0.1503 mg、柴胡皂苷e 0.0127 mg、柴胡皂苷f 0.0290 mg的回收率對(duì)照品溶液；取柴胡藥材粉末0.5 g，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入回收率對(duì)照品溶液25 mL（相當(dāng)于藥材含量100%），按“2.3”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果6種成分的回收率均在95.56%～104.91%，RSD均在0.61%～2.4%，說明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 相對(duì)校正因子測(cè)定

2.5.1 相對(duì)校正因子 采用多點(diǎn)校正法[16-18]，即以多個(gè)濃度點(diǎn)計(jì)算所得的相對(duì)校正因子的平均值作為定量用相對(duì)校正因子f，公式為Fs/k＝（Ms×Ak）/（Mk×As）（Ms為內(nèi)參物質(zhì)量，Mk為待測(cè)物質(zhì)質(zhì)量，As為內(nèi)參物峰面積，Ak為待測(cè)物質(zhì)峰面積）。取柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f 對(duì)照品，精密稱定，加甲醇配制成混合對(duì)照品溶液，并稀釋成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以柴胡皂苷d為內(nèi)參物，分別計(jì)算待測(cè)成分柴胡皂苷a、b2、c、e、f 的相對(duì)校正因子，結(jié)果5個(gè)待測(cè)成分的相對(duì)校正因子分別為0.9990、4.4151、0.7235、0.9614、0.7972。

2.5.2 耐用性考察 分別考察柱溫38、42℃，流速0.40、0.50 mL·min－1對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表3。不同色譜條件下各皂苷的相對(duì)校正因子RSD均小于3.0%，耐用性良好。

表3 相對(duì)校正因子的耐用性結(jié)果Tab 3 Durability of relative correction factors

2.6 QAMS與ESM的測(cè)定結(jié)果比較

取8批市場購買的柴胡藥材，把地下部位和殘莖分開處理，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別采用ESM和QAMS方法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表4。采用SPSS 20.0軟件對(duì)兩種方法計(jì)算的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果兩組5個(gè)成分之間均無顯著性差異（Pssa＝0.95、Pssb2＝0.77、Pssc＝0.75、Psse＝0.94、Pssf＝0.99，均大于0.05），證明QAMS 在柴胡藥材的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用是可行的。

表4 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果(mg·g－1)Tab 4 Content determination results of QAMS and ESM (mg·g－1)

2.7 柴胡藥材不同部位皂苷類成分含量差異研究

2.7.1 柴胡藥材不同部位主成分分析 柴胡藥材不同部位皂苷類成分含量見表5。以柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f 的含量為變量，采用PCA法對(duì)表5中8批柴胡藥材的根和殘留莖進(jìn)行分析。PCA得分圖見圖2。整體來看，8批柴胡藥材的根和殘留莖在PCA 得分圖中可被明顯區(qū)分為2個(gè)區(qū)域。根和殘留莖被明顯區(qū)分，說明柴胡藥材的根和殘留莖在化學(xué)成分方面具有差異性。

圖2 8批柴胡藥材的PCA 得分圖Fig 2 PCA score of 8 batches of Bupleuri Radix

2.7.2 柴胡藥材皂苷類成分分布規(guī)律研究 基于上述結(jié)果，柴胡藥材殘莖中的柴胡皂苷含量要遠(yuǎn)低于根。為研究柴胡藥材中皂苷類成分的分布規(guī)律，對(duì)市購的8批柴胡藥材根和殘莖分別進(jìn)行了分段處理，檢測(cè)其中的皂苷類成分含量，結(jié)果顯示柴胡皂苷總量，柴胡皂苷a、d的總量以及柴胡皂苷a、b2、c、d、e、f 6個(gè)成分的含量分布規(guī)律均為：莖2 cm以上＜莖1～2 cm＜莖0～1 cm＜根0～1 cm＜根1～2 cm＜根2 cm以下，見表5、圖3。

圖3 柴胡不同部位皂苷含量Fig 3 Content of saikosaponins in different parts of Bupleuri Radix

表5 柴胡不同部位皂苷含量結(jié)果(mg·g－1)Tab 5 Content of saikosaponin in different parts of Bupleuri Radix (mg·g－1)

續(xù)表5

3 討論

3.1 色譜條件的考察

UPLC具有靈敏度高、分離度好等特點(diǎn)，與HPLC相比縮短了分析時(shí)間，同時(shí)減少了溶劑用量，降低了分析成本，適用于解決中藥組分復(fù)雜、分離困難等問題。因此，本試驗(yàn)建立了UPLC-PDA同時(shí)測(cè)定柴胡中6種皂苷含量的分析方法。對(duì)比了含5% 氨水的甲醇溶液、100%甲醇溶液對(duì)柴胡藥材中柴胡皂苷類的提取效率，結(jié)果表明含5% 氨水的甲醇溶液提取效率明顯高于100%甲醇溶液。在流動(dòng)相的選擇上，考察了乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸溶劑系統(tǒng)，以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰分離效果好，基線平穩(wěn)。同時(shí)，考察了Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）3種型號(hào)的色譜柱，最終發(fā)現(xiàn)色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）對(duì)各峰分離效果優(yōu)于其余色譜柱，故選擇其用于含量測(cè)定方法的建立。

柴胡皂苷a、c、d、e、f最大吸收波長為205 nm，而柴胡皂苷b2在254 nm 有最大吸收，為確保6 種柴胡皂苷均能很好地響應(yīng)，綜合考慮確定在雙波長下同時(shí)測(cè)定6種柴胡皂苷的含量。

3.2 一測(cè)多評(píng)法質(zhì)量評(píng)價(jià)

柴胡皂苷d是柴胡藥材的主要特征成分之一，含量較高，其對(duì)照品容易獲得，質(zhì)量穩(wěn)定，本試驗(yàn)采用QAMS法對(duì)柴胡藥材中6種皂苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定，選用柴胡皂苷d作為內(nèi)參物，對(duì)8批柴胡藥材的不同部位中6種皂苷類成分進(jìn)行測(cè)定，分別采用ESM和QAMS計(jì)算，結(jié)果兩種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明QAMS可以用于柴胡藥材中6種皂苷類成分的含量測(cè)定。

3.3 柴胡藥材藥用部位的討論

柴胡藥材的地上部分和地下部分的皂苷含量差異較大，地下部分皂苷含量要遠(yuǎn)高于地上部分。文獻(xiàn)報(bào)道柴胡藥材的根和莖葉中的化學(xué)成分具有明顯區(qū)別[19-21]，地上部分的黃酮類成分含量較高[22-23]；另外柴胡地上和地下部分在藥效學(xué)上存在差異[24-26]，如北柴胡地下部分根具有保肝作用，而其地上部分無此作用，在解熱、抗炎等作用方面也有區(qū)別[27-29]。

本研究的8個(gè)樣品中地下部分柴胡皂苷a、d含量在0.53%～1.60%，全部符合《中國藥典》總量不得低于0.30%的規(guī)定；地上殘留莖部分只有2個(gè)樣品的柴胡皂苷a，d 總量在0.30%～0.49%，其余均不符合藥典規(guī)定，因此，地上殘留莖部分不可以作為柴胡的藥用部位。

研究發(fā)現(xiàn)殘莖中柴胡皂苷的含量是隨著長度的增加呈遞減趨勢(shì)的，然而即使是靠近根部的莖0～1 cm部分的6個(gè)柴胡皂苷的總量也只有地下根部的14%，建議柴胡藥材加工過程中應(yīng)盡量除去殘莖，減少殘莖摻雜，保證藥材的質(zhì)量。