宜昌地區(qū)人群CYP2C19和PON1基因型分布與氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究

奚煒，賈亮亮*，金桂蘭，邢翔飛，彭官良，徐幫，閆喜明（.宜昌市第一人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443000；2.三峽大學(xué)藥物制劑研究所，湖北 宜昌 443000）

氯吡格雷作為P2Y12受體拮抗劑，通過(guò)選擇性地抑制二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）與其血小板P2Y12受體的結(jié)合及繼發(fā)的ADP介導(dǎo)的糖蛋白 GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物的活化，從而產(chǎn)生抑制血小板聚集的作用[1]。有臨床研究報(bào)道，部分患者服用標(biāo)準(zhǔn)劑量氯吡格雷（75 mg·d－1）進(jìn)行抗血小板治療后并不能取得預(yù)期的抑制血小板聚集的效果，臨床上將這個(gè)現(xiàn)象稱之為氯吡格雷抵抗[2-3]。研究表明，細(xì)胞色素P4502C19（cytochrome P450 2C19，CYP2C19）和對(duì)氧磷酶1（paraoxonase-1，PON1）基因多態(tài)性與氯吡格雷在體內(nèi)吸收代謝存在明確關(guān)聯(lián)性，是導(dǎo)致氯吡格雷療效減弱甚至治療失敗的重要影響因素[4]。CYP2C19基因代謝表型和基因表型的分布有明顯的種族和地域差異。慢代謝型在中國(guó)人群中發(fā)生率近15%[5]，在白種人中發(fā)生率僅為3%[6]。不同地區(qū)和民族CYP2C19基因型和代謝型有明顯的差異[7]，宜昌地處鄂西南，是一個(gè)土家族聚居、多民族雜居的地區(qū)。全市現(xiàn)有少數(shù)民族人口47.2萬(wàn)人（據(jù)第六次人口普查），占全市總?cè)丝诘?1.63%，其中土家族占全部少數(shù)民族人口的87.4%。因此，通過(guò)分析宜昌地區(qū)CYP2C19和PON1基因型分布與氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)的流行病學(xué)調(diào)查對(duì)于本地患者氯吡格雷的安全有效服用更具有指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1－12月在本院就診并服用氯吡格雷的266例患者進(jìn)行CYP2C19和PON1基因多態(tài)性檢測(cè)，共檢測(cè)952個(gè)位點(diǎn)，包含男性175人，女性91人。其中檢測(cè)3個(gè)位點(diǎn)（CYP2C19*2、CYP2C19*3、PON1）的人數(shù)為112人，檢測(cè)4個(gè)位點(diǎn)（CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17和PON1）的人數(shù)為154人。納入本研究的患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試藥

患者每人采集外周靜脈血3 mL（EDTA抗凝），采取熒光染色原位雜交分析技術(shù)對(duì)患者血液標(biāo)本進(jìn)行CYP2C19*2（rs4244285，c.681G＞A），CY-P2C19*3（rs4986893，c.636G＞A），CYP2C19*17（rs12248560，c.-806C＞T）和PON1（rs662）基因型檢測(cè)。L998A型熒光檢測(cè)儀（西安天隆科技有限公司）；BY-400C型醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；核酸純化試劑、基因檢測(cè)通用試劑和10×NH4Cl溶液（北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP2C19和PON1基因型分布

納入本研究的人群中CYP2C19*2基因以GG型為主，為123例（46.24%）；AA型為43例（16.17%）；等位基因A突變概率為34.96%。CYP2C19*3基因以GG型為主，為232例（87.22%）；GA型為34例（12.78%）；等位基因A突變概率為6.39%。CYP2C19*17基因以CC型為主，為153例（99.35%）；CT型為1例（0.65%）；等位基因T突變概率為0.32%。PON1基因以GA型為主，為127例（47.74%）；GG型為111例（41.73%）；AA型為28例（10.53%）；等位基因A突變概率為34.40%。納入本研究人群中，CYP2C19*2，CYP2C19*3，CYP2C19*17和PON1等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），表明研究對(duì)象具有代表性，詳見表1。

表1 患者CYP2C19和PON1基因型及等位基因的頻率分布Tab 1 Frequency of CYP2C19 and PON1 genotypes and alleles in patients

2.2 不同性別 CYP2C19和PON1基因型分布

通過(guò)分析患者CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17和PON1在男女患者基因型分布發(fā)現(xiàn)，CYP2C19*2的3種基因型在男性和女性間分布不同（P＜0.05）。CYP2C19*3、CYP2C19*17、PON1不同基因型在男性和女性之間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 CYP2C19和PON1基因型在不同性別間多態(tài)性分布Tab 2 Polymorphism of CYP2C19 and PON1 genotypes between genders

通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在266例患者中女性CYP2C19*2基因突變率顯著高于男性（41.76%vs31.43%，P＝0.018），結(jié)果提示女性發(fā)生氯吡格雷抵抗的風(fēng)險(xiǎn)可能高于男性，詳見表3。

表3 CYP2C19和PON1等位基因在不同性別間多態(tài)性分布Tab 3 Polymorphism of CYP2C19 and PON1 alleles between genders

2.3 CYP2C19和PON1代謝型分布及氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)度分析

CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17以及PON1各位點(diǎn)基因的突變會(huì)造成代謝酶活性的改變，因此根據(jù)各位點(diǎn)突變的情況可將CYP2C19和PON1代謝酶分為4種不同的代謝類型：超快代謝型（UM），快代謝型（RM），中間代謝型（IM）和慢代謝型（PM）。

在納入的266例患者中，CYP2C19和PON1代謝類型主要為正常代謝型和中間代謝型。其中有1例患者CYP2C19代謝類型為超快代謝型，將本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)[8-11]發(fā)表的不同種族人群CYP2C19代謝型比較發(fā)現(xiàn)，宜昌地區(qū)人群CYP2C19代謝型的分布與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)不同種族人群分布有顯著差異，詳見表4。

表4 宜昌與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)民族患者 CYP2C19 代謝表型的比較Tab 4 CYP2C19 metabolic phenotypes in Yichang and other ethnic patient groups in China

PON1酶是氯吡格雷代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，控制著2-O-氯吡格雷生成活性產(chǎn)物，PON1編碼基因突變會(huì)使PON1酶活性下降[12]。PON1GG純合，氯吡格雷活性代謝物水平高；AG雜合，氯吡格雷活性代謝物水平中等，有部分氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)；AA純合，氯吡格雷活性代謝物水平低，有氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)。本次納入研究的266例患者中，111例PON1代謝型為GG純合，提示無(wú)氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)；127例PON1代謝型為AA純合型，提示存在部分氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)；28例PON1代謝型為AA純合型，提示存在明確的氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)。

氯吡格雷的代謝受多種酶的調(diào)控[13]，納入分析的酶的種類越多，其氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估越準(zhǔn)確。本研究通過(guò)結(jié)合患者CYP2C19和PON1兩種酶的代謝類型來(lái)計(jì)算患者服用氯吡格雷出血或發(fā)生血栓風(fēng)險(xiǎn)的風(fēng)險(xiǎn)度值更為準(zhǔn)確。通過(guò)北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司提供的氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)度分級(jí)計(jì)算方法（由公司技術(shù)人員重點(diǎn)依據(jù)CPIC指南，CYP2C19基因型與氯吡格雷治療及TRITON-TIMI 38研究結(jié)果得出），將患者發(fā)生氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)度分為5個(gè)等級(jí)，見表5。

表5 患者氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)度分析Tab 5 Risk analysis of clopidogrel resistance in patients

在納入研究的266例患者中，有1例CYP2C19代謝類型為超快代謝型，但其PON1代謝類型為中間代謝型（基因型為GGGGCTGA），綜合評(píng)價(jià)該患者氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)度為0，該患者按常規(guī)氯吡格雷劑量給藥，應(yīng)可獲預(yù)期療效。臨床藥師在患者出院后1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月的隨訪過(guò)程中，該發(fā)現(xiàn)患者按照每日75 mg劑量服用氯吡格雷，未發(fā)現(xiàn)出血等不良反應(yīng)。266名納入研究的患者中，氯吡格雷使用風(fēng)險(xiǎn)度≥2的患者有131人，占比49.2%，提示49.2%的患者服用氯吡格雷后存在氯吡格雷抵抗。針對(duì)這類患者需要增加氯吡格雷的使用劑量或換藥為替格瑞洛。

3 討論

氯吡格雷是一種前體藥物，其在肝臟中經(jīng)CYP450酶代謝后生成能選擇性抑制ADP與其血小板P2Y12受體的結(jié)合活性產(chǎn)物而發(fā)揮抑制血小板聚集的作用。其中CYP2C19酶在氯吡格雷生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮非常重要的作用。CYP2C19是由CYP2C19基因編碼，存在高度的種族分布差異和遺傳多態(tài)性[14]。有研究表明，CYP2C19等位基因中*2、*3、*17基因的突變可明顯影響對(duì)氯吡格雷代謝，*2、*3等位基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致CYP2C19酶活性降低，*17等位基因發(fā)生突變會(huì)增強(qiáng)CYP2C19酶活性，增加血風(fēng)險(xiǎn)[15-16]。依據(jù)各位點(diǎn)突變的類型，可將CYP2C19酶分為4種類型：快代謝型（RM，*1/*1）；超快代謝型（UM，*1/*17，*17/*17）；中間代謝型（IM，*1/*2，*1/*3，*17/*2，*17/*3）；慢代謝型（PM，*2/*2，*2/*3，*3/*3）[17]。常規(guī)劑量的氯吡格雷在慢代謝型患者中產(chǎn)生的活性代謝物減少，抑制血小板聚集作用下降，形成血栓風(fēng)險(xiǎn)增加；在超快代謝型患者中產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物增加，抑制血小板聚集作用增強(qiáng)，出血風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，2010年美國(guó)FDA修改的氯吡格雷說(shuō)明書中黑框警示：CYP2C19基因型檢測(cè)結(jié)果應(yīng)作為醫(yī)師調(diào)整治療策略的參考。

在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，有些CYP2C19野生型的患者常規(guī)劑量服用氯吡格雷后仍存在療效不佳現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)PON1基因多態(tài)性對(duì)氯吡格雷的吸收和代謝也存在重要影響[18]。PON1酶是氯吡格雷代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，控制著2-O-氯吡格雷生成活性產(chǎn)物，PON1編碼基因突變會(huì)使PON1酶活性下降[12]。PON1GG純合，氯吡格雷活性代謝物水平高，血小板活性被抑制程度高，幾乎無(wú)氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)。該基因發(fā)生突變?yōu)锳G雜合或AA純合，氯吡格雷活性代謝物水平下降，血小板活性被抑制，存在氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)，半年后出現(xiàn)支架血栓的風(fēng)險(xiǎn)比為4.52[19]。韓國(guó)一項(xiàng)研究也同樣證明，PON1突變會(huì)增加心肌梗死、缺血事件、支架血栓等風(fēng)險(xiǎn)[20]。

本次檢測(cè)的266例患者中，CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17主要為野生純合型，占比分別為46.24%和87.22%以及99.35%，基因突變的頻率為34.96%和6.39%以及0.32%。通過(guò)進(jìn)一步分析患者CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17和PON1在男女患者基因型分布發(fā)現(xiàn)，CYP2C19*2在男性和女性間3種基因型分布不同，女性CYP2C19*2（G＞A）基因突變率高于男性（P＝0.018），表明女性發(fā)生氯吡格雷抵抗的風(fēng)險(xiǎn)可能更高。PON1不同基因型在男性和女性之間分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

266例患者中PON1基因型以GA雜合型為主，占比47.74%，基因突變的頻率34.40%。結(jié)合患者CYP2C19及PON1基因型計(jì)算患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的風(fēng)險(xiǎn)度。結(jié)果顯示有50.8%的患者氯吡格雷抵抗風(fēng)險(xiǎn)較低（風(fēng)險(xiǎn)度為0和1），對(duì)于這部分患者給予按正常劑量服用氯吡格雷的用藥建議[21]。有20%的患者存在部分氯吡格雷抵抗（風(fēng)險(xiǎn)度為2），對(duì)于這類患者，按常規(guī)氯吡格雷劑量給藥，氯吡格雷轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物效率下降，因此給予加大氯吡格雷劑量到150 mg的用藥建議[22]。有29.4%的患者存在氯吡格雷抵抗（風(fēng)險(xiǎn)度為3和4），因此給予將氯吡格雷換為替格瑞洛90 mg bid的用藥建議[21]。

本次調(diào)研中，發(fā)現(xiàn)宜昌地區(qū)CYP2C19快代謝型流行率為39%，IM型中間代謝型流行率為39%，慢代謝型流行率為21%。發(fā)現(xiàn)1例超快代謝型患者。通過(guò)該研究了解本地區(qū)的心腦血管疾病患者CYP2C19基因型分布情況。目前研究發(fā)現(xiàn)氯吡格雷的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)通路上除了與CYP2C19、PON1有關(guān)外，還與CYP2C9、CYP3A4、CYP3A5和P2Y12R等基因的變異有關(guān)，同時(shí)合并藥物的藥物間相互作用等因素均會(huì)影響氯吡格雷在體內(nèi)的抗血小板作用[23]。下一步，我們將納入更多監(jiān)測(cè)指標(biāo)，擴(kuò)大研究樣本量，對(duì)本地區(qū)心腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，以及介入治療后的抗凝、抗血小板治療提供個(gè)體化用藥依據(jù)，降低患者再次發(fā)生血栓風(fēng)險(xiǎn)，提高治療效果。