Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化芍藥甘草湯的提取工藝

劉蕾蕾，劉冬涵，張紫薇，畢嘉謠，鐘宛凌，杜守穎，白潔（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

芍藥甘草湯出自東漢名醫(yī)張仲景所著《傷寒論》，收錄于國家中醫(yī)藥管理局公布的第一批《古代經(jīng)典名方目錄》，方由白芍、炙甘草組成，是仲景為誤汗亡陽，陽復(fù)后的腳攣急證而設(shè)[1]，目前，對(duì)芍藥甘草湯的研究多集中在藥理作用機(jī)制及臨床應(yīng)用方面，尚未見其有關(guān)其現(xiàn)代制劑工藝的研究報(bào)道。

根據(jù)規(guī)定，在經(jīng)典名方現(xiàn)代制劑的開發(fā)過程中，必須以物質(zhì)基準(zhǔn)為核心抓手，保證現(xiàn)代制劑和傳統(tǒng)湯劑質(zhì)量屬性的一致性[2]。提取工藝的參數(shù)優(yōu)化不是以轉(zhuǎn)移率為目標(biāo)，而是通過關(guān)鍵質(zhì)量屬性保證提取物與物質(zhì)基準(zhǔn)的一致性[3]。用現(xiàn)代提取工藝開發(fā)制劑，調(diào)整工藝參數(shù)使其與古方用砂鍋煎煮湯液的關(guān)鍵質(zhì)量屬性一致，是本試驗(yàn)的重點(diǎn)。

芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括芍藥苷、甘草苷、甘草酸的含量，出膏率和指紋圖譜相似度。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)范圍，響應(yīng)面法可以通過給定的響應(yīng)值范圍確定在該范圍內(nèi)的因素水平，因此本文選擇響應(yīng)面法對(duì)其制劑工藝進(jìn)行優(yōu)化。首先確立物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，然后選一批對(duì)應(yīng)的飲片進(jìn)行提取工藝的考察，以指標(biāo)性成分含量和出膏率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，使提取液與物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性保持一致。

1 儀器與試藥

JM-B10002電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BSA 224S電子分析天平、MC京制00000246號(hào)電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Thermo Fisher U3000 高效液相色譜儀[DAD檢測(cè)器，CM7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DZF-6051型真空干燥器（北京利康達(dá)圣科技有限公司）；G20型醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；FD-2A型真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司）。

白芍飲片（浙江磐安縣，批號(hào)：20190801～20190805；四川中江，批號(hào)：20190901～20190905）和炒甘草飲片（自炮）經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授分別鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia.lactifloraPall.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。

芍藥苷（批號(hào)：110736-201842，含量：97.4%）、甘草苷（批號(hào)：111610-201607，含量：93.1%）、甘草酸銨（批號(hào)：110731-201720，含量：97.7%）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇、磷酸（Fisher，色譜級(jí)）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 物質(zhì)基準(zhǔn)制備

稱取白芍55.20 g、炒甘草55.20 g，加飲用水600 mL，武火煮沸轉(zhuǎn)文火煎煮65 min（按古方考證之后的煎煮方式），300目尼龍篩網(wǎng)濾過，濾液放冷至室溫，精密移取10 mL藥液至30 mL西林瓶中，凍干72 h（冷凝器溫度－86℃，樣品溫度－40.9℃，真空4 Pa），取出加塞壓蓋，即得物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物。

2.2 物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜方法的建立

2.2.1 色譜條件 Purospher RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～6 min，95%B；6～10 min，95%→88%B；10～19 min，88%→85%B；19～25 min，85%→81%B；25～30 min，81%B；30～40 min，81%→75%B；40～50 min，75%→60%B；50～60 min，60%→50%B；60～65 min，50%→95%B）；流速為1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長為230 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為5 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉1支，精密移取5 mL水復(fù)溶，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，離心濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 精密度考察 取同一份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其指紋圖譜，圖譜導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件》（2012版本）進(jìn)行分析，計(jì)算圖譜之間的相似度，結(jié)果均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性考察 取同一批次供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件平行進(jìn)樣，測(cè)定其指紋圖譜，計(jì)算圖譜之間的相似度，結(jié)果均大于0.99，表明該法測(cè)定的重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算不同圖譜之間的相似度，結(jié)果均大于0.99，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 16批物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜研究 將10批白芍（浙江磐安5批、四川中江5批）與10批炒甘草（內(nèi)蒙古鄂爾多斯）飲片隨機(jī)組合，按“2.1”項(xiàng)下方法制備16批物質(zhì)基準(zhǔn)，取物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，得HPLC指紋圖譜，見圖1。對(duì)色譜圖進(jìn)行全譜峰匹配，相似度在0.939～0.998，相似度良好，說明物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝穩(wěn)定。

圖1 16批芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of 16 batches of Shaoyao Gancao decoction substance benchmark

2.3 物質(zhì)基準(zhǔn)中芍藥苷的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 采用Purospher RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）等度洗脫；流速為1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長為230 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為5 μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品15.05 mg置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為 2.93 mg·mL－1的對(duì)照品母液。將對(duì)照溶液母液用甲醇稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為0.14、0.36、0.90、1.50、1.88、2.35 mg·mL－1的芍藥苷對(duì)照溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取凍干粉約0.3 g，精密稱定，置5 mL量瓶中，甲醇溶解后超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3.4 方法學(xué)考察 根據(jù)2020年版《中國藥典》[4]分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行芍藥苷含量測(cè)定的方法學(xué)考察。結(jié)果表明儀器精密度、供試品溶液穩(wěn)定性（24 h內(nèi)）、重復(fù)性、加樣回收率及方法專屬性均良好（見表1及圖2）。

2.3.5 物質(zhì)基準(zhǔn)中芍藥苷的含量 取16批芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每批平行3份，取平均值，結(jié)果見表2，芍藥苷含量在0.54%～1.00%，均值為0.77%。

2.4 物質(zhì)基準(zhǔn)中甘草苷、甘草酸的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 采用Purospher RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）梯度洗脫（0～8 min，86%B；8～15 min，86%→82%B；15～20 min，82%B；20～35 min，82%→50%B；35～36 min，50%→0%B），流速為1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長為237 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為5 μL。

2.4.2 甘草苷、甘草酸混合對(duì)照品溶液的制備精密稱定甘草苷20.17 mg、甘草酸銨23.05 mg，置10 mL量瓶中，70%乙醇溶解并定容，即得含甘草苷1877.83 μg·mL－1、甘草酸2206.31 μg·mL－1的混合對(duì)照品母液。精密移取混合對(duì)照品溶液母液，用70%乙醇稀釋，分別配制一系列質(zhì)量濃度的甘草苷、甘草酸對(duì)照溶液，測(cè)定峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.3 供試品溶液的制備 取凍干粉約0.3 g，精密稱定，置5 mL量瓶中，加入70%乙醇，超聲處理30 min，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4.4 方法學(xué)考察 根據(jù)2020年版《中國藥典》[4]分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，按“2.4.1”項(xiàng)下液相條件進(jìn)行甘草苷、甘草酸含量測(cè)定的方法學(xué)考察。結(jié)果表明儀器精密度、供試品溶液穩(wěn)定性（24 h內(nèi)）、重復(fù)性、加樣回收率及方法專屬性均良好（見表1及圖2）。

表1 芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)成分含量測(cè)定的方法學(xué)考察Tab 1 Methodology on determination of index components in substance benchmark of Shaoyao Gancao decoction

圖2 芍藥苷（A）和甘草苷、甘草酸（B）專屬性測(cè)定色譜圖Fig 2 Chromatogram of specificity determination of paeoniflorin（A）and liquiritin and glycyrrhizinic acid（B）

2.4.5 物質(zhì)基準(zhǔn)甘草苷、甘草酸的含量 取16批芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每批平行3份，取平均值，結(jié)果見表2。結(jié)果表明16批物質(zhì)基準(zhǔn)中甘草苷含量在0.45%～0.75%，均值為0.60%，甘草酸含量在0.38%～0.64%，均值為0.51%。

表2 16批物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)性成分含量測(cè)定及出膏率結(jié)果Tab 2 Content of index components and dry extract rates of 16 batches of substance benchmark

2.5 物質(zhì)基準(zhǔn)出膏率測(cè)定

精密移取煎煮后藥液100 mL，轉(zhuǎn)移至已知重量的蒸發(fā)皿中，60℃減壓干燥，稱重，計(jì)算出膏率。公式為出膏率＝m/M×100%，式中m表示干膏粉的質(zhì)量，M表示飲片初始質(zhì)量（方重），結(jié)果見表2。16批物質(zhì)基準(zhǔn)的出膏率在15.37%～21.07%，均值為18.35%。

2.6 提取液各指標(biāo)的測(cè)定

稱取白芍55.20 g、炒甘草55.20 g，置于合適圓底燒瓶中，加入一定體積的飲用水回流提取，300目尼龍篩網(wǎng)濾過，放冷至室溫，飲用水補(bǔ)足體積，精密移取水液3 mL至10 mL離心管中，10 000 r·min－1離心5 min，取上清液進(jìn)樣。測(cè)定芍藥苷、甘草苷、甘草酸的含量及出膏率。

2.7 單因素試驗(yàn)初步篩選提取工藝

為盡可能客觀地反映各個(gè)因素對(duì)芍藥甘草湯提取工藝的影響，擬采用綜合加權(quán)評(píng)分法，將各個(gè)指標(biāo)以綜合評(píng)分（OD）的形式進(jìn)行考察，對(duì)綜合評(píng)分進(jìn)行直觀分析[5-6]。各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)均為0.25，綜合評(píng)分（OD）＝0.25×（芍藥苷含量＋甘草苷含量＋甘草酸含量＋出膏率）

根據(jù)文獻(xiàn)[7-10]和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，以綜合評(píng)分為指標(biāo)，選定提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、3 h）和加水倍量（5、10、15、20倍）進(jìn)行單因素考察，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯鲭S提取時(shí)間加長，綜合評(píng)分逐漸增加，提取2 h后評(píng)分增加漸緩，所以將響應(yīng)面提取時(shí)間高水平定為2 h；加水倍量在5～20倍時(shí)，綜合評(píng)分隨加水量的增大而增加，加水至20倍時(shí)超出物質(zhì)基準(zhǔn)70%～130%的綜合評(píng)分范圍，所以將加水倍量高水平定為15倍。

圖3 各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響Fig 3 Effect of various factors on the comprehensive score

2.8 Box-Behnken 法優(yōu)化芍藥甘草湯提取工藝

按照 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)基本原理，在前期單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，優(yōu)化選取加水倍量（A）、提取次數(shù)（B）和提取時(shí)間（C）3 個(gè)影響因素，以芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量及出膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù) Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Tab 3 Factor and level

2.8.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，每組平行3次，結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab 4 Box-Behnken design and results

2.8.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 采用 Design-Expert 10 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行模型擬合，擬合分析結(jié)果見表5，由結(jié)果可知有兩個(gè)模型的擬合結(jié)果的P值均小于0.05，根據(jù)有多個(gè)擬合模型結(jié)果顯著時(shí)，選擇最高階多項(xiàng)式模型的原則，故而選擇二階多項(xiàng)式模型進(jìn)行方程擬合。

表5 多種模型擬合分析Tab 5 Multiple model fitting analysis

對(duì)擬合模型進(jìn)行ANOVA方差分析，由表6可知，回歸方程使用的模型P＜0.05，表明此模型有效可靠。失擬項(xiàng)是用來表示模型與試驗(yàn)擬合的程度，本次模型的失擬項(xiàng)P值為0.3766＞0.05，表明該模型無失擬因素存在，模型與實(shí)際值能較好地?cái)M合。模型相關(guān)系數(shù)R2＝0.9357，說明該模型能解釋93.57% 響應(yīng)值的變化；調(diào)整決定系數(shù)adj-R2＝0.8531，說明可信度較好，可以運(yùn)用該模型分析?；貧w方程為：綜合評(píng)分＝0.93＋0.055A＋0.19B＋0.039C－0.025AB＋0.022AC＋0.046BC－0.017A2－0.10B2－0.066C2。

表6 回歸模型方差分析結(jié)果Tab 6 ANOVA of the regression model

該模型中，因素A、B、B2的P＜0.05或P＜0.001，表明加水倍量和提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響較顯著，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響順序?yàn)樘崛〈螖?shù)＞加水倍量＞提取時(shí)間。此外，各影響因素之間還存在交互作用。不同交互因素與綜合評(píng)分的響應(yīng)面分析見圖4。圖4A及圖4B的響應(yīng)面圖坡度較陡，表明加水倍量與提取次數(shù)時(shí)間、提取次數(shù)與提取時(shí)間交互作用較強(qiáng)，對(duì)綜合評(píng)分的影響顯著，圖C 的響應(yīng)面圖坡度平緩，表明加水倍量與提取時(shí)間的交互作用較弱，對(duì)綜合評(píng)分的影響較小。

圖4 各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig 4 Response surface and contour plot of interactive effect on the comprehensive score

2.8.3 優(yōu)選工藝的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 采用Design-Expert 10軟件對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)物質(zhì)基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的70%～130%質(zhì)量離散范圍，將各指標(biāo)范圍均定離散范圍內(nèi)，綜合評(píng)分的范圍限制為高為0.362，低為0.670，得到最優(yōu)工藝預(yù)測(cè)為加水5.134倍，提取1.016次，提取時(shí)間為0.555 h，此條件下計(jì)算的理論綜合評(píng)分為0.510。為方便實(shí)際試驗(yàn)操作，將最佳工藝調(diào)整為加水5倍，回流40 min提取1次，驗(yàn)證提取工藝的可行性。

經(jīng)過3次驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得的芍藥苷、甘草苷、甘草酸單處方含量均值分別為0.61%、0.61%、0.64%，出膏率均值為17.68%，綜合評(píng)分為0.508，與響應(yīng)面法預(yù)測(cè)值相接近，同時(shí)也在物質(zhì)基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的70%～130%的離散范圍內(nèi)，3次驗(yàn)證試驗(yàn)指紋圖譜的對(duì)照?qǐng)D譜（S1）與物質(zhì)基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)照?qǐng)D譜（S2）相似度比較結(jié)果為0.997（見圖5），均符合質(zhì)量要求。

圖5 芍藥甘草湯物質(zhì)基準(zhǔn)（S2）與驗(yàn)證試驗(yàn)（S1）圖譜Fig 5 Chromatogram of the substance benchmark（S2）and verification experiment（S1）of Shaoyao Gancao decoction

3 討論

物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制包括指標(biāo)性成分含量、特征圖譜相似度以及出膏率3個(gè)指標(biāo)，前期考察發(fā)現(xiàn)藥材的產(chǎn)地與批次差異對(duì)湯劑的指紋圖譜影響不大，同時(shí)17次響應(yīng)面試驗(yàn)的指紋圖譜相似度均大于0.95，所以綜合評(píng)分的設(shè)立不包括指紋圖譜相似度，只需驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)與物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物的相似度。

在綜合評(píng)分的比例分配上，由于本方只有兩味藥材，包含3個(gè)指標(biāo)性成分，均在藥典考察之列，所以重要程度相當(dāng)，同時(shí)因?yàn)槌龈嗦蕰?huì)影響后續(xù)制得顆粒的服用量，所以綜合評(píng)分設(shè)立了4個(gè)指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)占比相同。

在單因素試驗(yàn)的設(shè)計(jì)上，結(jié)合經(jīng)驗(yàn)與文獻(xiàn)初步篩選影響芍藥甘草湯提取工藝的因素，發(fā)現(xiàn)加水倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素對(duì)含量和出膏影響較大，故而將這3個(gè)因素作為響應(yīng)面的設(shè)計(jì)因素。此外一般提取次數(shù)增加到一定程度時(shí)，藥材中的有效成分已基本提取完全，再增加提取次數(shù)也難以使成分含量有較大改變[11]。所以直接將提取次數(shù)3個(gè)水平設(shè)定為1、2、3次。

響應(yīng)面法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，可有效減少試驗(yàn)次數(shù)，并可直觀體現(xiàn)影響因素之間的交互作用[12]。通過響應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝時(shí)，軟件給出的最優(yōu)工藝在實(shí)際生產(chǎn)中并不能實(shí)現(xiàn)，綜合考量之后將加水量定為5倍，同時(shí)延長了提取時(shí)間變?yōu)?0 min，而芍藥苷具有熱不穩(wěn)定性[13]，可能是導(dǎo)致實(shí)際獲得芍藥苷比預(yù)測(cè)值偏低的原因，而甘草苷、甘草酸含量以及出膏率都與最佳工藝預(yù)測(cè)值相當(dāng)，表明響應(yīng)面法預(yù)測(cè)的可靠性。直觀分析里第12組響應(yīng)面試驗(yàn)綜合評(píng)分為0.50，與預(yù)測(cè)的0.51也較接近，但可能由于加熱時(shí)間太長使得芍藥苷含量減少低于物質(zhì)基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)范圍，所以舍棄?？紤]到后續(xù)顆粒劑的質(zhì)量，對(duì)提取液濃縮干燥后的干膏粉進(jìn)行了含量測(cè)定，也在物質(zhì)基準(zhǔn)范圍內(nèi)，在確定了提取這個(gè)對(duì)含量影響最大的工藝后，后續(xù)可以通過略微調(diào)整濃縮干燥工藝進(jìn)一步調(diào)整干膏粉的含量，以確保最終得到的制劑與芍藥甘草湯劑質(zhì)量一致。應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化法得到的芍藥甘草湯提取工藝穩(wěn)定可靠，與物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量一致，可以作為后續(xù)顆粒劑的提取方法。