羅哌卡因納米粒的制備及鎮(zhèn)痛研究

劉江，王藝嬌，趙健輝，王雪梅，劉占軍*（.華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 06320；2.唐山工人醫(yī)院麻醉科，河北 唐山 063000）

羅哌卡因（ropivacaine，RVC）是一種新型酰胺類局部麻醉藥，廣泛用于各種臨床手術(shù)和其他急性和慢性疼痛。RVC皮下注射的鎮(zhèn)痛作用時(shí)間一般為6 h，為了延長(zhǎng)鎮(zhèn)痛時(shí)間，必須持續(xù)給藥，增加了不良反應(yīng)發(fā)生率和給藥負(fù)擔(dān)，為此開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效且安全的局部麻醉藥十分重要。

海藻酸鈉（sodium alginate，SA）是一種水溶性的天然多聚糖，無(wú)毒，可降解，無(wú)免疫反應(yīng)，生物相容性好[1-4]，適合應(yīng)用為乳化增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、抗原、酵素、微生物和基因的載體等[5]。SA具有較強(qiáng)的親水性，但機(jī)械性能較差，載藥量較低且存在藥物突釋，因此用作藥用載體時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行修飾改性。

丙烯酸類均聚物和共聚物具有很好的生物相容性，廣泛用作藥用輔料，如腸溶包衣材料，緩釋控釋制劑中水凝膠型骨架材料和黏膜黏附片劑等[6]。聚甲基丙烯酸甲酯[poly（methyl methacrylate），PMMA]具有很強(qiáng)的疏水性，與疏水性藥物具有親和作用，在控釋制劑或緩釋制劑載體中適合用作疏水鏈段。SA與PMMA接枝納米粒（nanoparticles，NP），可延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，促進(jìn)藥物吸收。

本研究擬采用RAFT法，在SA上接枝PMMA，然后負(fù)載RVC制備SA-g-PMMA納米粒（RVC/SAg-PMMA NP），通過(guò)紅外光譜、熱穩(wěn)定性及形態(tài)、粒徑分布等考察其材料性能，研究載藥、藥物釋放及在昆明小鼠體內(nèi)的鎮(zhèn)痛作用。

1 材料

1.1 試藥

羅哌卡因鹽酸鹽（中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：94.5%，批號(hào)：100866-201302）；甲基丙烯酸甲酯（MMA）（分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，重蒸后使用）；SA（分析純，天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所）；偶氮二異丁腈（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP，分析純）（上海阿拉丁試劑有限公司）；乙腈（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑）；三硫代碳酸二酯（根據(jù)文獻(xiàn)自制[7]）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 動(dòng)物

昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（25±2）g [華阜康SCXK（京）2014-0004，華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買]，自由進(jìn)食、飲水（凈化水），喂小鼠專用飼料。

1.3 儀器

Nano ZS90激光粒度分析儀（英國(guó)馬爾文儀器公司）；EXSTAR series TG/DTA7200 熱重分析儀（日本SII Nano Technology Inc 公司）；H-7650型透射電鏡（日本Hitachi公司）；1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀（日本Shimadzu公司）；MD10-14型透析袋（截留相對(duì)分子量1400）（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司）。

2 方法及結(jié)果

2.1 SA-g-PMMA NP的制備

NP及SA-g-PMMA NP的制備結(jié)合文獻(xiàn)方法進(jìn)行改進(jìn)[7-8]，基本步驟如下：SA按文獻(xiàn)方法[9]降解，達(dá)到10～15 kDa。在反應(yīng)器中依次加入1.6 g MMA，0.04 g三硫代碳酸二酯，0.003g偶氮二異丁腈和30 mL苯，通入N2除去反應(yīng)器中的氧氣，持續(xù)30 min，于70℃條件下反應(yīng)20 h。于冰水混合物中冷卻至室溫，用丙酮沉淀出PMMA大分子鏈轉(zhuǎn)移劑。以DCC為脫水劑，DMAP為催化劑，反應(yīng)器中加入SA、大分子鏈轉(zhuǎn)移劑、DMAP、DCC，在20 mL二氯甲烷中常溫反應(yīng)24 h。在丙酮中沉淀產(chǎn)物，干燥后得到SA-g-PMMA接枝共聚物。SA-g-PMMA接枝共聚物直接與適量純凈水混合，自組裝成SA-g-PMMA NP。接近飽和的RVC鹽酸鹽中，在常溫下，滴加氨水，直至稍過(guò)量，并不斷攪拌，去離子水洗滌沉淀，在50℃恒溫干燥，得到RVC游離堿。將SA-g-PMMA和RVC游離堿充分混合均勻，常溫下溶于去離子水中，通過(guò)自組裝得到RVC/SA-g-PMMA NP。

2.2 制劑的表征

2.2.1 紅外光譜 采用KBr壓片法：樣品與光譜純KBr研磨混合后，加壓20 MPa，3 min后取出，室溫條件下測(cè)定4000～400 cm－1光譜，結(jié)果見(jiàn)圖1。SA-g-PMMA NPs出現(xiàn)特征吸收峰：1731.8 cm－1處為羰基C＝O的伸縮振動(dòng)吸收峰。在SA上3328.7 cm－1為-OH伸縮振動(dòng)吸收峰，286.9 cm－1為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1602.4 cm－1和1425.1 cm－1分別為COO－不對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，1158.5 cm－1和1011.9 cm－1為C-O-C（環(huán)）骨架振動(dòng)[10]。在形成接枝物后，SA-g-PMMA NP上的各吸收峰值，因化學(xué)環(huán)境的變化都稍有變化，證明了PMMA成功接枝到了SA上。圖1c為RVC/SA-g-PMMA NP，-OH吸收峰明顯變寬，是由于RVC上的-NH和＝O與SA結(jié)合成氫鍵，其他吸收峰變化不大。

圖1 紅外光譜圖Fig 1 FTIR spectra

2.2.2 熱分析 樣品的熱重分析采用TGA儀器進(jìn)行，樣品從室溫條件以10℃·min－1勻速升溫至650℃，采用氮?dú)獗Ｗo(hù)。TGA曲線見(jiàn)圖2。

圖2 熱重分析圖Fig 2 Thermal gravimetric analysis

由圖2可知，SA涉及3個(gè)不同失重區(qū)，初始重量損失區(qū)為25～112℃，這是由于存在水分，加熱后水分失去；第二個(gè)失重區(qū)為246～347℃，是由于COO－基團(tuán)的降解及CO2損失（脫羧）所致；第三個(gè)失重區(qū)為347～650℃，是由于SA主鏈降解所致。SA-g-PMMA納米粒第一個(gè)失重區(qū)SA比SA-g-PMMA重量降低要多些，這是由于樣品中的水分較多，PMMA鏈段在受熱過(guò)程中比較穩(wěn)定，在整個(gè)加熱失重過(guò)程中不會(huì)發(fā)生化學(xué)變化。而載藥納米粒（RVC/SA-g-PMMA NPs）在失重過(guò)程中，前兩個(gè)失重區(qū)比較趨勢(shì)變化不明顯，在第三失重區(qū)明顯有更多重量損失，主要是因?yàn)镽VC在較高溫度下分解所致。

2.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 分別取SA-g-PMMA和RVC/SA-g-PMMA混懸液，適當(dāng)稀釋后用銅網(wǎng)制樣，用2%磷鎢酸溶液負(fù)染，于透射電鏡下進(jìn)行觀察。兩種納米形態(tài)如圖3所示，均為類球形，載藥后的規(guī)整程度下降，分布也更分散，SA-g-PMMA和RVC/SA-g-PMMA的平均粒徑分別為（165.2±3.4）nm和（287.3±5.6）nm。

圖3 透射電鏡圖（30 000×）Fig 3 Transmission electron micrograph（30 000×）

2.2.4 粒徑分布 負(fù)載RVC的納米粒與空白納米粒配制成0.1%（W/V）的溶液，超聲10 min，使溶液中納米粒均勻分散，利用動(dòng)態(tài)光散射法（條件：633 nm、25℃、4 mW、He-Ne）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 空白納米粒（a）及載藥納米粒（b）粒度分布Fig 4 Size of blank SA-g-PMMA NPs（a）and RVC/SA-g-PMMA NPs（b）

測(cè)得空白納米粒的平均粒徑為（183.7±3.7）nm，多分散系數(shù)（PDI）為（0.238±0.016），如圖4a，分布較為均一，表明在制備過(guò)程中只有SAg-PMMA一種材料，生成納米粒條件簡(jiǎn)單，容易得到分布窄的納米粒。測(cè)得載藥納米粒的平均粒徑為（309.1±9.3）nm，PDI為（0.392±0.081），如圖4b。載藥后粒徑分布變寬，且粒徑大幅度增加，與載藥后體積增加及粒子間發(fā)生聚集有關(guān)。

2.3 RVC的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件[11]色譜柱：Zorbax Eclipse SDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）-乙腈溶液（1∶1）；等度洗脫，柱溫：25℃；檢測(cè)器：DAD（190～600 nm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；流速：1 mL·min－1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密配制RVC 8.98、13.47、44.9、67.35、112.25、134.7、168.38 μg·mL－1的對(duì)照品溶液。用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以RVC質(zhì)量濃度（C）對(duì)峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：A＝6.343C＋5.391，r＝0.9995，表明質(zhì)量濃度與峰面積在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 方法學(xué)驗(yàn)證 測(cè)得RVC的HPLC圖見(jiàn)圖5。溶劑和空白SA-g-PMMA對(duì)RVC含量的測(cè)定不產(chǎn)生干擾，證明該方法的專屬性良好。日內(nèi)精密度、日間精密度、加樣回收率及穩(wěn)定性均符合分析的要求（RSD值均小于5%）。

圖5 RVC的HPLC色譜圖Fig 5 HPLC of RVC

2.4 載藥量和包封率的測(cè)定

精密稱取適量的載藥納米粒，用乙腈溶解于25 mL量瓶中，超聲3 min（超聲時(shí)每隔5 s超聲5 s）后，用有機(jī)濾膜（孔徑：0.1 μm）過(guò)濾，RVC含量按“2.3”項(xiàng)下HPLC法測(cè)定。按下式計(jì)算RVC載藥量和包封率。

RVC載藥量（%）＝（納米粒中的RVC量/納米粒的總質(zhì)量×100）%；

RVC包封率（%）＝（納米粒中的RVC量/投料RVC的總質(zhì)量×100）%。

不同藥品與納米粒質(zhì)量比對(duì)于載藥量和包封率的影響如表1所示，當(dāng)質(zhì)量比較低時(shí)具有較高的包封率，但載藥量低，隨著質(zhì)量比的增加，載藥量增加。但質(zhì)量比過(guò)高時(shí)會(huì)導(dǎo)致載藥納米粒的粒徑增大[12-13]。綜合考慮選擇質(zhì)量比為0.6時(shí)較好，載藥量為（3.59±0.16）%，包封率為（94.1±2.7），粒徑為（309.1±9.3）nm。

表1 載藥量和包封率Tab 1 Loading capacity and encapsulation efficiency

2.5 體外藥物釋放的測(cè)定

使用透析袋法研究了RVC從SA-g-PMMA NPs的釋放。準(zhǔn)確稱取載藥SA-g-PMMA NPs和RVC各5 mg，分別加入pH為7.4的PBS緩沖液，配制成5 mL溶液，密封在透析袋中。將透析袋放入37℃恒溫下裝有0.5 L PBS（pH 7.4）的玻璃燒杯中，以100 r·min－1的速度攪拌。在預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)，取出5 mL透析液，過(guò)濾，用HPLC測(cè)定RVC含量。同時(shí)，補(bǔ)充等體積的同溫度的PBS緩沖液。結(jié)果如圖6所示，純RVC溶液中RVC的釋放較快，在0.5 h內(nèi)藥物釋放達(dá)80%以上。載藥SA-g-PMMA NPs表現(xiàn)出持續(xù)釋放行為，24 h釋放藥物不到50%，72 h接近80%。

圖6 體外藥物釋放曲線Fig 6 In vitro drug release profile

2.6 小鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

體內(nèi)鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)使用電刺激法[14]進(jìn)行。剃掉小鼠的腹部鼠毛，用20 V和15 V電壓分別刺激小鼠的預(yù)注射部位，以小鼠對(duì)電刺激的反應(yīng)發(fā)出的嘶叫次數(shù)作為痛覺(jué)閾值，篩選合格小鼠，隨機(jī)均衡分組，每組8只。將RVC/SA-g-PMMA NPs、RVC溶液（均含2 mg RVC），分別皮下注射到小鼠腹部，然后分別在給藥前及給藥后固定時(shí)間電刺激小鼠腹部，記錄電刺激達(dá)到痛覺(jué)閾值的次數(shù)。如果一組中的所有小鼠沒(méi)有發(fā)出高于閾值嘶叫次數(shù)，則表明鎮(zhèn)痛效果為100%；如果一組中有一半的小鼠對(duì)電刺激發(fā)聲，則意味著有50%的鎮(zhèn)痛作用。如果一組中的所有小鼠對(duì)電刺激都高于閾值嘶叫次數(shù)，則表示鎮(zhèn)痛效果為0%，無(wú)鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果如圖7所示，RVC溶液在2 h內(nèi)就完全失去鎮(zhèn)痛作用，而RVC/SA-g-PMMA NPs在20 h后仍然保持50%以上的鎮(zhèn)痛作用。

圖7 小鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛時(shí)長(zhǎng)曲線Fig 7 In vivo analgesia duration curve in mice

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用RAFT法進(jìn)行SA-g-PMMA NPs的制備，RAFT法最大的優(yōu)點(diǎn)是可以根據(jù)分子設(shè)計(jì)需要改變接枝率的高低，相關(guān)的更深入研究還在進(jìn)行中。納米粒在自組裝載藥過(guò)程中，RVC進(jìn)行堿化過(guò)程使其與疏水鏈段PMMA具有更好的親和性能，在藥物釋放過(guò)程中達(dá)到緩釋目的。本研究結(jié)果表明制備的納米材料，具有較好的熱穩(wěn)定性，載藥后能夠達(dá)到延緩藥物釋放的目的，在小鼠體內(nèi)能夠延長(zhǎng)鎮(zhèn)痛時(shí)間。后期課題組還計(jì)劃開(kāi)展納米接枝率對(duì)載藥及緩釋的影響，納米材料的生物相容性等相關(guān)研究，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。