綿馬貫眾有效部位微丸的處方工藝優(yōu)化及溶出特性研究

楊錦，高增平，尹興斌，曲昌海，倪?。ū本┲嗅t(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

綿馬貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨Dryopteris crassirhizomaNakai的干燥根莖和葉柄殘基，味苦，性微寒，有小毒，歸肝、胃經(jīng)，具有清熱解毒、驅(qū)蟲(chóng)的功效，常用于治療時(shí)疫感冒、風(fēng)熱頭痛、溫毒發(fā)斑、瘡瘍腫毒、崩漏下血、蟲(chóng)積腹痛?，F(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)多個(gè)含有綿馬貫眾的中藥復(fù)方被用于治療流感，如雙貫清感滴丸、連花清瘟膠囊和貫黃感冒顆粒等[1-4]。

綿馬貫眾中的有效成分綿馬貫眾素ABBA具有良好的抗流感病毒作用[5]，對(duì)感染流感病毒小鼠的保護(hù)率達(dá)90%。本課題組采用特殊提取工藝，對(duì)其有效成分進(jìn)行富集，成功制得綿馬貫眾有效部位（GZP），主成分含量超過(guò)50%，同樣具有良好的抗流感作用。但研究發(fā)現(xiàn)，GZP中大部分成分難溶于水，不利于藥物的溶出和吸收。因此本文采用制劑學(xué)手段，采用一定技術(shù)對(duì)GZP進(jìn)行處理后，再采用擠出滾圓技術(shù)制備成微丸增加藥物的比表面積[6]；并通過(guò)單因素試驗(yàn)法結(jié)合Box-Behnken效應(yīng)面法，以溶出度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)微丸的處方進(jìn)行優(yōu)化，以期提高藥物溶解度，增加藥物的溶出。

1 儀器與試藥

CML濕法制粒擠出滾圓一體機(jī)（caleva）；ZRS-8G智能溶出試驗(yàn)儀（天津精拓儀器科技有限公司）；ACQUITY I-CLASS ＆ PAD超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；SK7210HP KUDOS超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；METTLER TOLEDO萬(wàn)分之一分析天平、XS205 DualRang型分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司）。

吐溫80（天津倫斯生物技術(shù)有限公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；甲酸（質(zhì)譜純，DikmaPure）；乙酸銨（分析純，北京化工廠）；高純水（Milli-Q超純水系統(tǒng)制備）；0.22 μm 微孔濾膜（津騰公司）；聚維酮 K30（PVP K30）、微晶纖維素101（MCC 101）（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；淀粉、乳糖、交聯(lián)聚維酮（PVP-P）、低取代羥丙纖維素（L-HPC）、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉（CCMC-Na）（北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司）；羧甲基淀粉鈉（CMS-Na，西安天正藥用輔料有限公司）；羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD，一鳴精細(xì)化工有限公司）；抗壞血酸、D-異抗壞血酸鈉[石藥集團(tuán)維生藥業(yè)（石家莊）有限公司]；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。

綿馬貫眾有效部位（自制，綿馬貫眾素ABBA含量為58.42%，批號(hào)：20201116）；綿馬貫眾素ABBA（自制，純度為94.20%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：含0.1%甲酸、10 mmol·L－1乙酸銨的甲醇（A）-含0.1%甲酸、10 mmol·L－1乙酸銨的水（B），梯度洗脫（0～3 min，80%～84%A；3～12 min，84%～89%A；12～13 min，89%～100%A；13～19 min，100%～80%A）；進(jìn)樣量：1 μL；流速：0.3 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：298 nm；柱溫：40℃；樣品室溫度：25℃。

2.2 GZP微丸單因素考察

2.2.1 制備工藝因素考察 微丸中最常用的成型促進(jìn)劑為MCC[7-8]，本研究中采用MCC 101作填充劑，0.5% PVP K30水溶液為黏合劑，以微丸收率、休止角、丸條性狀為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察擠出速度（40、50、60、70 r·min－1）、滾圓速度（1200、1500、1800 r·min－1）、滾圓時(shí)間（3、5、7 min）對(duì)微丸成型的影響。結(jié)果表明，各擠出速度下微丸休止角均小于40°，說(shuō)明微丸流動(dòng)性滿足要求，結(jié)合收率和生產(chǎn)效率選定擠出速度為60 r·min－1；當(dāng)滾圓速度為1500 r·min－1時(shí)，微丸收率略高于其他組，且微丸粒徑相對(duì)均一，因此選定1500 r·min－1作為滾圓速度；當(dāng)滾圓時(shí)間為5 min和7 min時(shí)，微丸的粒徑均較為均勻，但隨著滾圓時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生較多細(xì)粉，因此選定滾圓時(shí)間為5 min。

2.2.2 黏合劑濃度考察 微丸成型預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用MCC與乳糖混合制備微丸時(shí)，微丸成型性較好，因此設(shè)定藥物與填充劑的比例為1∶3，填充劑中MCC的比例為66.67%，以收率、休止角、微丸外觀為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察PVP K30水溶液作黏合劑時(shí)[9]，其濃度對(duì)微丸成型的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)黏合劑濃度為0.5%和1%時(shí)，收率和休止角無(wú)顯著差異，說(shuō)明黏合劑濃度對(duì)微丸成型無(wú)影響，因此根據(jù)微丸圓整度選定黏合劑為0.5% PVP K30水溶液。

2.2.3 崩解劑的種類(lèi)和用量篩選 在微丸制備過(guò)程加入適量崩解劑，可以有效提高微丸崩解速率，從而提高藥物溶出速率[10-13]。固定崩解劑用量為5%，以微丸收率、休止角、微丸外觀為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察崩解劑CMS-Na、PVP-P、L-HPC、CCMC-Na對(duì)微丸成型的影響。結(jié)果顯示，各組微丸收率均高于90%，休止角均小于30°，流動(dòng)性良好，說(shuō)明崩解劑的種類(lèi)對(duì)于微丸成型無(wú)影響，結(jié)合藥物性質(zhì)選用CMS-Na為崩解劑。分別制備CMS-Na用量為1%、5%和8%的微丸，置于37℃、100 r·min－1和900 mL含5%吐溫80的水溶液中，以微丸崩解時(shí)間為指標(biāo)，考察崩解劑的用量。結(jié)果顯示，崩解劑用量對(duì)微丸崩解時(shí)間有顯著影響，當(dāng)崩解劑用量為5%和8%時(shí)崩解時(shí)間差異不明顯，因此選定崩解劑用量為5%。

2.2.4 填充劑中MCC的比例考察 MCC作為骨架材料顯著影響微丸后期釋藥速率，且乳糖作為致孔劑，能夠顯著提高釋藥速率[14]。因此選用MCC與乳糖為填充劑，以45 min時(shí)微丸的溶出度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察填充劑中MCC的比例為66.67%、50.00%、33.33%、20.00%時(shí)對(duì)微丸溶出度的影響。結(jié)果顯示，隨著MCC比例的降低，溶出度逐漸提高，但當(dāng)MCC比例繼續(xù)降低時(shí)微丸成型較差，因此初步確定填充劑中MCC的比例可選擇20%左右。

2.2.5 增溶方法考察 參考文獻(xiàn)[15-18]方法，考察HP-β-CD共研以及PEG 6000制備固體分散體對(duì)GZP的增溶效果。具體操作如下：

將HP-β-CD共混物（按質(zhì)量比0.5∶1稱(chēng)取HP-β-CD與藥物適量，混合均勻后于研缽中共研30 min）和固體分散體（稱(chēng)取3.00 g PEG 6000于80℃下水浴至熔融狀態(tài)，逐量加入3.00 g GZP，攪拌均勻，迅速于－18℃下放置4 h，真空干燥過(guò)夜后，粉碎過(guò)80目篩）。按處方比例加入其他輔料，混合均勻后制備微丸，以45 min時(shí)微丸溶出度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察增溶方法。結(jié)果顯示，HP-β-CD處理后的GZP微丸的溶出度超過(guò)50%，顯著高于固體分散體組（27.14%），因此選用HPβ-CD共研法對(duì)藥物進(jìn)行預(yù)處理后，再制備微丸。

2.2.6 HP-β-CD與藥物的比例考察 參考文獻(xiàn)[19-20]對(duì)HP-β-CD與藥物的比例進(jìn)行考察。稱(chēng)取適量HP-β-CD與藥物混合均勻并共研30 min預(yù)處理后，按表1比例加入其他輔料制備微丸，其中1-1組和1-2組微丸均可成型，而1-3組微丸無(wú)法成型。

表1 微丸處方參數(shù)及微丸性狀評(píng)價(jià)Tab 1 Pellet formulation parameters and character evaluation

分別稱(chēng)取1-1組和1-2組微丸，以45、90、180 min時(shí)累積溶出度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選定較為適宜的微丸處方。結(jié)果表明，兩組微丸溶出行為較為接近，且45 min時(shí)1-1組微丸溶出度超過(guò)50%，因此結(jié)合微丸性狀選定1-1組為較優(yōu)處方。

2.3 微丸溶出度的測(cè)定

2.3.1 溶出介質(zhì)的選擇 根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，為保證達(dá)到漏槽條件，選擇含5%吐溫80的PBS溶液（pH＝6.8）作為溶出介質(zhì)，考察1-1組微丸的溶出情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微丸的溶出度在后期呈現(xiàn)明顯的降低趨勢(shì)。由于GZP中含有較多的間苯三酚類(lèi)成分，推測(cè)可能是由于其酚羥基發(fā)生氧化反應(yīng)從而降解，因此考慮在溶出介質(zhì)中加入適量抗氧劑[21]。

以藥物的穩(wěn)定效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)抗氧劑的種類(lèi)和用量進(jìn)行篩選，主要考察煮沸和加入不同量的抗壞血酸、D-異抗壞血酸鈉的抗氧化效果。以溶出介質(zhì)為溶劑，配制一定濃度的藥物溶液，并加入抗壞血酸（5 mg·mL－1）、D-異抗壞血酸鈉（5、2、1 mg·mL－1），于37℃，100 r·min－1條件下恒溫水浴振搖，分別于0 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h取樣，續(xù)濾液進(jìn)樣，計(jì)算藥物濃度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，測(cè)得濃度和0 min時(shí)藥物濃度的比值為縱坐標(biāo)繪制藥物穩(wěn)定性曲線圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。2 mg·mL－1和5 mg·mL－1的D-異抗壞血酸鈉對(duì)于藥物的穩(wěn)定效果較好，其中5 mg·mL－1組藥物濃度相對(duì)更為平穩(wěn)，因此選定抗氧化劑為5 mg·mL－1的D-異抗壞血酸鈉。

圖1 不同抗氧劑下的藥物穩(wěn)定性曲線圖Fig 1 Stability curves of drugs with different antioxidants

2.3.2 溶出度的方法學(xué)研究

① 專(zhuān)屬性考察：分別用溶出介質(zhì)溶解對(duì)照品、樣品和空白輔料，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣1 μL，記錄色譜圖，結(jié)果如圖2所示，空白溶出介質(zhì)和輔料對(duì)綿馬貫眾素ABBA的測(cè)定沒(méi)有干擾。

圖2 綿馬貫眾有效部位微丸UPLC色譜圖Fig 2 UPLC chromatogram of pellets from effective parts of Dryopteris crassirhizoma Nakai

② 精密度考察：取綿馬貫眾素ABBA對(duì)照品適量，溶出介質(zhì)溶解，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD小于3%，說(shuō)明精密度良好。

③ 線性考察：精密稱(chēng)定綿馬貫眾素ABBA 6.36 mg于25 mL量瓶中，加入溶出介質(zhì)超聲至溶解，定容，逐級(jí)稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為2.41、4.82、9.63、48.17、96.34、143.79、191.72、239.64 μg·mL－1的系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程為y＝8.112×103x－1.707×104（R2＝0.9996）。表明綿馬貫眾素ABBA在2.41～239.64 μg·mL－1內(nèi)與峰面積線性良好。

④ 樣品穩(wěn)定性考察：稱(chēng)取適量樣品，溶出介質(zhì)溶解，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，保留時(shí)間和峰面積的RSD小于3%，說(shuō)明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

⑤ 回收率考察：精密稱(chēng)取樣品約50%、80%、100%各3份，按處方比例加入空白輔料，溶出介質(zhì)溶解，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，低、中、高組的回收率平均值分別為97.25%、97.36%、95.90%，RSD均小于3%。

2.3.3 溶出度測(cè)定方法 根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》四部通則0931溶出度測(cè)定第二法（槳法），以900 mL含5%吐溫80和5 mg·mL－1D-異抗壞血酸鈉的PBS溶液（pH＝6.8）為溶出介質(zhì)，溶出溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min－1，微丸投樣量為0.3 g，分別于5 min、30 min時(shí)取樣，并及時(shí)補(bǔ)加同溫等體積溶出介質(zhì)，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算微丸累積溶出度。

2.4 Box-Behnken效應(yīng)面法（BBD）優(yōu)化微丸處方

2.4.1 因素水平表及試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素考察結(jié)果，分析GZP微丸制劑工藝的影響因素和各因素所取水平，固定藥物與填充劑的比例為1∶3，黏合劑為0.5% PVP K30水溶液，擠出速度60 r·min－1，滾圓速度1500 r·min－1，滾圓時(shí)間5 min，選取HP-β-CD與藥物的比例（A）、填充劑中MCC的比例（B）、CMS-Na用量（C）作為考察因素，結(jié)合BBD設(shè)計(jì)原理，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，見(jiàn)表2，按BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，以5 min時(shí)累積溶出度（Y1）和30 min時(shí)累積溶出度（Y2）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)表與結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 因素水平Tab 2 Factor and level

2.4.2 模型擬合 應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)各水平進(jìn)行多元非線性回歸，得到二項(xiàng)式擬合的方程分別為：Y1＝6.10＋10.39A－5.18B＋0.17C－7.55AB＋0.51AC－0.46BC＋10.76A2＋8.82B2－7.19C2；Y2＝19.95＋18.64A－6.26B＋1.05C－9.24AB＋1.52AC－1.24BC＋14.76A2＋11.96B2－8.57C2；Y1和Y2的回歸方程的P值均小于0.05，說(shuō)明其多元回歸擬合模型成立。

表3 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(n＝2)Tab 3 BBD test design and results (n＝2)

2.4.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件分別繪制Y1、Y2對(duì)兩兩因素的三維效應(yīng)面圖，直觀描繪出各因素的影響，分別見(jiàn)圖3。鑒于本研究的目的是提高藥物的溶出度，因此在評(píng)價(jià)指標(biāo)中，選擇釋放速度越快越好。故設(shè)定Y1（5 min時(shí)累積溶出度）的取值范圍為50%～80%，以反映微丸的快速釋放過(guò)程；Y2（30 min時(shí)累積溶出度）的取值范圍為80%～100%，以反映微丸是否能夠釋放完全，將各效應(yīng)面對(duì)應(yīng)的等高線進(jìn)行疊加繪制二維等高線疊加圖，見(jiàn)圖4，圖中黃色區(qū)域?yàn)槔硐氲妮^優(yōu)區(qū)域，此時(shí)CMS-Na用量（C）固定為5%。

圖3 各因素對(duì)Y1（A）及Y2（B）影響的三維效應(yīng)面圖Fig 3 Effect of each factor on Y1（A）and Y2（B）three-dimensional effect surface diagram

圖4 處方優(yōu)化的二維等高線疊加圖Fig 4 Two-dimensional contour stacking diagram of prescription optimization

2.5 處方驗(yàn)證

根據(jù)試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，結(jié)合實(shí)際情況，選擇上述優(yōu)化區(qū)域中的處方，各因素為：HP-β-CD與藥物比例（A）為0.70，填充劑中MCC比例（B）為18.50%，CMS-Na用量（C）為5%，進(jìn)行微丸的制備，并分別測(cè)定微丸在5、30 min時(shí)累積溶出度，平行測(cè)定6組。結(jié)果如表4所示，Y1和Y2均滿足試驗(yàn)預(yù)設(shè)取值范圍，且RSD值均小于1%，說(shuō)明該處方穩(wěn)定合理。

表4 處方驗(yàn)證的溶出度測(cè)定結(jié)果Tab 4 Dissolution test results of prescription verification

3 討論

綿馬貫眾有效部位主要為水難溶性成分，現(xiàn)代制劑研究中對(duì)于難溶性成分主要采用滴丸、微丸等制劑形式通過(guò)增加藥物的比表面積以改善其溶解度和溶出速度，其中微丸的工藝技術(shù)較為成熟，因此本文采用擠出滾圓技術(shù)制備微丸。

MCC是制備微丸的常用輔料，是微丸成型促進(jìn)劑，但MCC易形成骨架材料，乳糖與之搭配使用，可以在骨架中迅速溶解形成孔道，吸引水分進(jìn)入微丸內(nèi)部，并加入適量崩解劑進(jìn)一步加快微丸崩解速度，從而促進(jìn)藥物的釋放。鑒于藥物難溶于水的性質(zhì)，采用羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)藥物預(yù)處理后，使得微丸溶出度得到顯著提升。

溶出度研究中發(fā)現(xiàn)藥物成分在溶液中穩(wěn)定性較差，因此在溶出介質(zhì)中加入適量抗氧劑，使其穩(wěn)定性增強(qiáng)。并在此基礎(chǔ)上采用二維等高線疊加及Box-Behnken效應(yīng)面法選定最優(yōu)處方工藝區(qū)域，對(duì)于處方的選擇具有良好的指導(dǎo)作用。

在后續(xù)的研究中，將對(duì)羥丙基-β-環(huán)糊精共研產(chǎn)物進(jìn)行更為深入的研究，從而觀察藥物的具體存在狀態(tài)，探索羥丙基-β-環(huán)糊精共研法增溶原理。