順鉑前藥及雙載藥聚乙二醇化脂質(zhì)體的制備、表征與體外抗腫瘤研究

王詠麒，朱嬌嬌，儲(chǔ)曉婷，張亞超，桂雙英，2，李真寶，2*（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 23002；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，合肥 23002）

順鉑（cisplatin，Pt）作為抗腫瘤藥物在各種惡性腫瘤的治療中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，但因耐藥和嚴(yán)重的劑量依賴(lài)性，其臨床應(yīng)用受到極大限制[1-2]。研究顯示，順鉑的耐藥機(jī)制源于多因素的細(xì)胞改變，包括順鉑的細(xì)胞積累減少、含硫醇分子[如抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽（GSH）等]對(duì)順鉑的解毒、DNA修復(fù)水平升高和自噬誘導(dǎo)等，這些因素導(dǎo)致順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷減少，導(dǎo)致治療效果大大降低[1]。

前藥策略是通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾來(lái)改善化療藥物的不良性質(zhì)[3]，四價(jià)順鉑前藥[Pt（Ⅳ）]具有八面體結(jié)構(gòu)，需到達(dá)還原環(huán)境后被激活釋放二價(jià)Pt（Ⅱ）片段方可發(fā)揮藥效[4-6]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞過(guò)量產(chǎn)生GSH（2～10 mmol·L－1），導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞呈高還原性微環(huán)境，近年來(lái)研究表明，這些高濃度的GSH能使鉑類(lèi)藥物失活[7-8]。下調(diào)或消耗胞內(nèi)的GSH，能夠克服順鉑耐藥，提高抗腫瘤效果[6，9]。L-丁硫氨酸-亞砜亞胺（L-BSO）是GSH合成過(guò)程中的限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCL）的抑制劑，能通過(guò)抑制GSH的合成，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，進(jìn)而提高治療效果[10-11]。

近年來(lái)，納米技術(shù)在藥物傳遞領(lǐng)域有著廣泛的研究，主要是通過(guò)制劑學(xué)方法延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，進(jìn)而通過(guò)高滲透長(zhǎng)滯留（EPR）效應(yīng)提高藥物在腫瘤部位的蓄積，以達(dá)到增強(qiáng)抗腫瘤效果的目的[12-13]。其中，聚乙二醇（PEG）化脂質(zhì)體具有長(zhǎng)循環(huán)、被動(dòng)靶向和增加藥物穩(wěn)定性的特點(diǎn)[14]，例如阿霉素脂質(zhì)體（Doxil?）已被應(yīng)用于臨床實(shí)踐中[15]。為了提高順鉑抗腫瘤效果，本課題構(gòu)建雙載藥PEG化脂質(zhì)體共遞送水溶性的Pt（Ⅳ）前藥和L-BSO。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

EX125ZH十萬(wàn)分之一電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司）；ME204E/02萬(wàn)分之一電子天平（上海梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（南京沃中儀器設(shè)備有限公司）；R201C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市英峪高科儀器廠）；LF-1脂質(zhì)體擠出器（加拿大AVESTIN）；Zetasizer 3000 HS（英國(guó)Malven）；JEOL-2010高分辨透射電子顯微鏡（日本電子）；DMi1倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica）；318C+全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海贛閩分析儀器有限公司）；HF90 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；DSX-18L高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；L4-6K臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；Specord S600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（德國(guó)Analytik Jena AG）。

1.2 試藥

順鉑（純度：95%，山東鉑源藥業(yè)有限公司）；丁二酸酐（純度：98%）、膽固醇（純度＞95.0%）（上海麥克林生化科技有限公司）；L-丁硫氨酸-亞砜亞胺（純度：99%，ACROS ORGANICS）；蛋黃卵磷脂（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇（DSPE-mPEG2K）（Corden Pharma Switerland LLC）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，無(wú)水級(jí)）、PBS、RPMI-1640培養(yǎng)基（大連美侖生物科技有限公司）；胎牛血清（美國(guó)Gemini），青霉素-鏈霉素溶液、胰酶細(xì)胞消化液-0.25%胰酶（上海碧云天科技有限公司）；CCK-8試劑盒（Biosharp）；氮?dú)猓ㄇ鄭u華奧焊割儀表有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；微量還原型谷胱甘肽測(cè)定試劑盒（Biological Industries）；二氯甲烷（CH2Cl2）、30%過(guò)氧化氫（H2O2）、丙酮、乙醚、乙醇和磷酸為分析純；甲醇為色譜純。

1.3 細(xì)胞

小鼠乳腺癌順鉑耐藥（4T1/DDP）細(xì)胞和小鼠乳腺癌（4T1）細(xì)胞由安徽中醫(yī)藥大學(xué)宋航教授課題組提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 順-二氯·反-二（丁二酸氫根）·順-二氨合鉑（Ⅳ）（DSCP）的制備

以順鉑為基礎(chǔ)，使用30% H2O2溶液氧化順鉑以增加兩個(gè)“-OH”軸向配體形成順-二氯·反-二羥基·順-二氨合鉑（Ⅳ）{cis，cis，trans-[PtCl2（OH）2（NH3）2]}，進(jìn)而在真空條件下與丁二酸酐發(fā)生酯化反應(yīng)生成具有雙羧基側(cè)鏈的Pt（Ⅳ）前藥——DSCP，合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 順-二氯·反-二（丁二酸氫根）·順-二氨合鉑（Ⅳ）的合成路線圖Fig 1 Synthetic route of DSCP

2.1.1 順-二氯·反-二羥基·順-二氨合鉑（Ⅳ）的合成及結(jié)構(gòu)表征 稱(chēng)取順鉑1.12 g置于250 mL圓底燒瓶中，加入75 mL 30% H2O2溶液，在75℃條件下回流反應(yīng)8 h，將反應(yīng)液降至室溫并于－20℃靜置過(guò)夜，抽濾，無(wú)水乙醇洗滌固體，25℃真空干燥得亮黃色晶體1.05 g，產(chǎn)率83%，紅外圖譜（IR）和質(zhì)譜（ESI-MS）結(jié)果見(jiàn)圖2。IR（KBr，cm－1）：3475，ν-OH；1587，δd-NH3；1445，1374，δS-NH3；1076，δ-PtOH；961，894，854，ρr-NH3；570，538，ν-PtO，ν-PtN。ESIMS＋，m/z：[M＋H]＋，334.97。

圖2 cis，cis，trans-[PtCl2（OH）2（NH3）2]的IR（A）和ESI-MS（B）圖譜Fig 2 IR（A）and ESI-MS（B）of cis，cis，trans-[PtCl2（OH）2（NH3）2]

2.1.2 DSCP的合成及結(jié)構(gòu)表征 稱(chēng)量cis，cis，trans-[PtCl2（OH）2（NH3）2] 200.4 mg（0.6 mmol）和丁二酸酐180.1 mg（1.8 mmol）置于50 mL圓底燒瓶中，加入8 mL無(wú)水DMF，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，30℃避光攪拌24 h得澄清黃色溶液。減壓旋蒸去除DMF得黃色油狀物，使用12 mL冰丙酮溶解，將溶液緩慢滴入快速攪拌的60 mL冰乙醚中析出沉淀。過(guò)濾得固體，乙醚清洗數(shù)次，25℃真空干燥后得淡黃色粉末，產(chǎn)率60%，純度為98.26%，核磁共振氫譜（1H-NMR）和ESI-MS結(jié)果見(jiàn)圖3。ESI-MS＋，m/z：[M＋H]＋，534.8755；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ12.20（2H，COOH），6.53（br，6H，-NH3），2.49（4H，OOC-CH2-），2.37（4H，-CH2-COOH）。

圖3 順-二氯·反-二（丁二酸氫根）·順-二氨合鉑（Ⅳ）的ESIMS（A）和1H-NMR（B）圖Fig 3 ESI-MS（A）and 1H-NMR（B）of DSCP

2.2 DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip的制備

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)4T1/DDP細(xì)胞，培養(yǎng)箱溫度37℃、含5%CO2，當(dāng)培養(yǎng)瓶底部覆蓋細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)，傳代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 DSCP和L-BSO投料比的篩選 稱(chēng)取適量的DSCP和L-BSO，采用去離子水溶解，按照不同摩爾比（12∶1、6∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶6、1∶12）配制DSCP和L-BSO的混合溶液，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1/DDP細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成3×104個(gè)·mL－1接種于96孔板，每孔100 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。棄去培養(yǎng)基，加入不同比例的DSCP和L-BSO混合溶液劑作為實(shí)驗(yàn)組（DSCP∶LBSO為12∶1、6∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶6、1∶12，其中DSCP的濃度為30 μmol·L－1），同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組（不給藥），每組6個(gè)復(fù)孔。給藥48 h后，棄去培養(yǎng)基，加入不含血清的培養(yǎng)基稀釋10倍的CCK-8溶液，每孔100 μL，3 h后用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定OD值，計(jì)算各組細(xì)胞生存率，結(jié)果見(jiàn)圖4A。同時(shí)，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)考察不同濃度L-BSO溶液對(duì)4T1/DDP細(xì)胞生存率的影響（見(jiàn)圖4B）。細(xì)胞生存率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組OD值－空白組OD值）/（對(duì)照組OD值－空白組OD值）×100%。

圖4 不同比例DSCP和L-BSO混合溶液劑（A）及不同濃度L-BSO溶液（B）對(duì)4T1/DDP細(xì)胞存活率的影響（Mean±SD，n＝6，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001）Fig 4 Effects of different proportions of DSCP and L-BSO mixed solutions（A）and different concentrations of L-BSO solutions（B）on the cell viability of 4T1/DDP cells（Mean±SD，n＝6，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001）

由結(jié)果可知，L-BSO溶液對(duì)4T1/DDP細(xì)胞存活率的影響較小，DSCP和L-BSO混合溶液劑對(duì)4T1/DDP細(xì)胞的抑制率隨著L-BSO在混合溶液中占比的增加而增加，當(dāng)DSCP和L-BSO混合溶液劑的摩爾比為1∶12時(shí)，4T1/DDP細(xì)胞的存活率最低，具有較好的協(xié)同效果。因此，接下來(lái)的研究中，DSCP和L-BSO的摩爾比設(shè)為1∶12。

2.2.3 DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip的制備 采用薄膜水化-擠出法制得目標(biāo)尺寸大?。ǎ?00 nm）的脂質(zhì)體，并用超濾離心法去除游離藥物。具體如下：稱(chēng)取蛋黃卵磷脂127.7 mg，膽固醇42.5 mg和DSPE-mPEG2K42.5 mg置于250 mL茄形瓶中，加入20 mL CH2Cl2形成脂質(zhì)體溶液，旋蒸除去CH2Cl2，制成均一的脂質(zhì)體膜，25℃真空干燥，加入DSCP和L-BSO混合溶液劑（含4 mg DSCP和20 mg L-BSO的去離子水溶液），磁力攪拌5 min，再加入4 mL去離子水，磁力攪拌2.5 h，即得到粗制的DSCP/L-BSO Lip。將其過(guò)0.22 μm濾膜，使用脂質(zhì)體擠出器（200 nm膜）擠出20次，即得到具有乳光的DSCP/L-BSO Lip。使用超濾離心管，3000 r·min－1離心20 min去除游離藥物，制備的DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip外觀為乳白色的液體，具有淡藍(lán)色乳光（見(jiàn)圖5）。

圖5 DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip的外觀圖Fig 5 Appearance shape of the DSCP Lip and DSCP/L-BSO Lip

DSCP Lip的制備同上述操作，將DSCP和L-BSO的混合溶液替換成DSCP溶液劑。

2.3 DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip的表征

2.3.1 粒徑與Zeta電位 將制備的DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip用去離子水稀釋10倍，采用Zetasizer 3000 HS激光粒度儀測(cè)定粒徑分布和Zeta電位，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip粒徑分布圖（A）和電位分布圖（B）Fig 6 Particle size distribution（A）and Zeta potential（B）of the DSCP Lip and DSCP/L-BSO Lip

DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip的平均粒徑分別為（154.88±2.67）nm和（143.66±1.25）nm，Zeta電位分別為（－42.84±0.07）mV和（－42.10±0.12）mV，PDI分別為（0.12±0.01）和（0.13±0.01），說(shuō)明所制得的DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip粒徑較小且分布較窄，有利于腫瘤細(xì)胞攝取內(nèi)吞脂質(zhì)體，增加L-BSO和DSCP的胞內(nèi)積累，進(jìn)而提高其抗腫瘤效果[16-18]。

2.3.2 形態(tài) 使用去離子水將脂質(zhì)體稀釋300倍，滴加到碳膜覆蓋的銅網(wǎng)（200目）上靜置1 min，自然干燥后用2%的磷鎢酸溶液負(fù)染2 min，在透射電鏡（TEM）下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)（見(jiàn)圖7）。

圖7 DSCP Lip（A）和DSCP/L-BSO Lip（B）的透射電鏡圖Fig 7 Transmission electron micrograph of DSCP Lip（A）and DSCP/L-BSO Lip（B）

DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip形態(tài)圓整，呈球狀，分散均勻，與Zetasizer 3000 HS激光粒度儀測(cè)定結(jié)果相比，TEM下干燥后的脂質(zhì)體的粒徑要比水合粒徑小，筆者推測(cè)是由于在TEM條件下，脂質(zhì)體表面的水化層的丟失造成的[19]。

2.3.3 穩(wěn)定性 以粒徑為考察指標(biāo)，考察DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip在10%大鼠血漿pH 7.4 PBS緩沖液中的穩(wěn)定性[20]。將1 mL脂質(zhì)體與9 mL 10%大鼠血漿pH 7.4 PBS混合均勻后，置于37℃，100 r·min－1搖床中，分別于0.5、2、4、8、12、24、48和72 h測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑變化（見(jiàn)圖8A）。

以粒徑為考察指標(biāo)，使用去離子水將脂質(zhì)體稀釋10倍，考察DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip在4℃條件下放置15 d的長(zhǎng)期穩(wěn)定性（見(jiàn)圖8B）。

圖8 DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip的穩(wěn)定性（Mean±SD，n＝3）Fig 8 Stability of DSCP Lip and DSCP/L-BSO Lip（Mean±SD，n＝3）A.72 h血漿穩(wěn)定性（stored at rat plasma for 72 h）；B.4℃長(zhǎng)期穩(wěn)定性（long term stability at 4℃）

從結(jié)果可以看出，DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip表現(xiàn)出較好的血漿穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性，這可能與脂質(zhì)體表面存在PEG水化層和－40 mV左右的Zeta電位有關(guān)，脂質(zhì)體粒子之間存在空間排斥作用，穩(wěn)定性較高[14，21]。

2.3.4 包封率和載藥量的測(cè)定

① DSCP標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定DSCP的含量，采用YMC-Pack ODS-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 ∶0.5%磷酸水（45∶55，V/V）；柱溫：25℃；流速：1.0 mL·min－1；波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

配制質(zhì)量濃度為1、5、10、25、50和100 μg·mL－1的DSCP溶液劑，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x進(jìn)行線性擬合，得回歸方程y＝0.4603x－0.1574，R2＝1.000，表明DSCP在1～100 μg·mL－1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

② L-BSO標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[22]：以鄰苯二酚為衍生劑使L-BSO衍生化，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-Vis）對(duì)L-BSO衍生物進(jìn)行檢測(cè)和定量，具體如下：先后向2 mL樣品溶液中添加0.5 mL含鄰苯二酚的pH 7.4 PBS溶液（2.4 mmol·L－1）和0.5 mL含高碘酸鈉的pH 7.4 PBS溶液（4.8 mmol·L－1），60 s后在503 nm固定波長(zhǎng)下測(cè)定L-BSO衍生物的吸光值。

配制質(zhì)量濃度為100、200、300、500、800和1000 μg·mL－1的L-BSO水溶液，按上述方法測(cè)定，以吸光值y對(duì)質(zhì)量濃度x進(jìn)行線性擬合，得回歸方程y＝0.0008x＋0.0541，R2＝0.9962，表明L-BSO在100～1000 μg·mL－1內(nèi)與吸光值線性關(guān)系良好。

③ 包封率和載藥量的測(cè)定：使用超濾離心法測(cè)定DSCP和L-BSO的包封率和載藥量。取3 mL脂質(zhì)體溶液至超濾離心管中，3000 r·min－1離心20 min，精密吸取濾液并定容，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，過(guò)0.45 μm濾膜，分別用HPLC和UV-Vis測(cè)定DSCP、L-BSO含量，計(jì)算DSCP和L-BSO的包封率（EE）和載藥量（DL），結(jié)果見(jiàn)表1。包封率（EE，%）＝脂質(zhì)體中藥物的重量/藥物的加入重量×100%；載藥量（DL，%）＝脂質(zhì)體中藥物的重量/（載體重量＋脂質(zhì)體中藥物的重量）×100%。

表1 DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip的包封率和載藥量(Mean±SD，n＝3)Tab 1 Encapsulation efficiency and drug loading of DSCP Lip and DSCP/L-BSO Lip (Mean±SD，n＝3)

由表1可看出，DSCP和L-BSO的包封率均在71%～73%，表明DSCP和L-BSO在脂質(zhì)體內(nèi)水相中的摩爾比依然保持在1∶12左右。

2.3.5 體外釋放考察 采用透析法考察DSCP在pH 7.4 PBS中的釋放行為。精密量取一定體積的DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip分別裝入預(yù)處理好的透析袋中，平行3份，兩端系好，放入50 mL PBS中，于120 r·min－1、37℃恒溫?fù)u床上震蕩，分別在0.5、1、2、4、6、8、10、12和24 h時(shí)間點(diǎn)取樣1 mL，并每次補(bǔ)加等體積新鮮的釋放介質(zhì)，過(guò)0.45 μm濾膜，HPLC測(cè)定DSCP的濃度，按照下式計(jì)算累積釋放百分比Q，結(jié)果見(jiàn)圖9。

Q＝[Ci×V1＋（C1＋C2＋…＋Ci-1）×V2]/M×100%

式中C1、C2、Ci-1、Ci分別是第1、2、i-1、i時(shí)間點(diǎn)釋放介質(zhì)中DSCP濃度；V1為釋放介質(zhì)總體積，V2為所取樣的體積；M為釋放前總藥量。

由圖9可知，DSCP的水溶性較好[23]，在pH 7.4 PBS釋放介質(zhì)中，DSCP的釋放速度較快，約在4 h釋放達(dá)到80%。

2.4 體外抗腫瘤評(píng)價(jià)

2.4.1 考察不同制劑對(duì)4T1/DDP和4T1細(xì)胞存活率的影響 同“2.2.2”項(xiàng)下操作，采用CCK-8法考察不同濃度的DSCP溶液劑、DSCP和L-BSO混合溶液劑、DSCP Lip、DSCP/L-BSO Lip和空白脂質(zhì)體對(duì)4T1/DDP細(xì)胞和4T1細(xì)胞存活率的影響，采用Graph Pad計(jì)算細(xì)胞存活率IC50，具體結(jié)果見(jiàn)圖10和表2。

表2 DSCP溶液、DSCP/L-BSO混合溶液、DSCP/Lip和DSCP/L-BSO Lip對(duì)4T1/DDP細(xì)胞和4T1細(xì)胞的IC50值(n＝6)Tab 2 IC50 of 4T1 and 4T1/DDP cells incubated with DSCP solution，DSCP and L-BSO mixed solutions，DSCP/Lip，and DSCP/L-BSO Lip (n＝6)

圖10 不同制劑對(duì)4T1/DDP細(xì)胞（A）和4T1細(xì)胞（B）存活率的影響以及不同濃度的空白脂質(zhì)體對(duì)4T1/DDP細(xì)胞和4T1細(xì)胞存活率的影響（C）（n＝6，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）Fig 10 Effect of different preparation on the cell viability of 4T1/DDP cells（A）and 4T1 cells（B）and effect of different proportions of blank liposome on the cell viability of 4T1/DDP cells and 4T1 cells（C）（n＝6，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

由結(jié)果可以看出，空白脂質(zhì)體安全性良好，對(duì)細(xì)胞的存活率無(wú)影響。DSCP溶液劑、DSCP和L-BSO混合溶液劑、DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip對(duì)4T1/DDP和4T1細(xì)胞均有明顯的抑制作用，且抑制作用隨藥物濃度的增大而增強(qiáng)。相對(duì)于DSCP溶液劑，DSCP和L-BSO混合溶液劑具有較高的細(xì)胞毒性，說(shuō)明DSCP和L-BSO具有協(xié)同抗腫瘤作用；同樣地，與DSCP Lip組相比，DSCP/L-BSO Lip的細(xì)胞抑制效果較強(qiáng)，說(shuō)明其具有較好的抗腫瘤效果。DSCP/L-BSO Lip組對(duì)兩種細(xì)胞的IC50均最小，說(shuō)明其體外抗腫瘤效果最好。

2.4.2 GSH濃度的測(cè)定 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1和4T1/DDP細(xì)胞，以2×105個(gè)·mL－1濃度加入到6孔板中，每孔3 mL，12 h后棄去培養(yǎng)液，加入DSCP溶液劑、DSCP和L-BSO混合溶液劑、DSCP Lip、DSCP/L-BSO Lip溶液處理（其中DSCP的濃度為60 μmol·L－1），設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后棄去含藥培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的PBS溶液清洗細(xì)胞表面2～3次，吸凈PBS。放置于冰上，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下并收集于超聲管，加入適量預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，超聲裂解細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，隨后在13 000 r·min－1低溫離心10 min，小心吸取上清液分管裝好暫存于－20℃?zhèn)溆?。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和微量還原型谷胱甘肽測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液內(nèi)細(xì)胞蛋白濃度和GSH含量，根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)GSH的濃度。結(jié)果見(jiàn)圖11。

細(xì)胞內(nèi)GSH濃度（μmol·g－1prot）＝[（測(cè)定孔OD值－空白孔OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)孔OD值－空白孔OD值）]×[20 μmol·L－1（GSH標(biāo)準(zhǔn)品濃度）/細(xì)胞蛋白濃度（g prot·L－1）]

從圖11可以看出，與4T1細(xì)胞相比，順鉑耐藥型4T1/DDP細(xì)胞具有較高的GSH濃度。無(wú)論是4T1和4T1/DDP細(xì)胞，與對(duì)照組DSCP溶液劑、DSCP和L-BSO混合溶液劑、DSCP Lip相比，DSCP/L-BSO Lip處理后，細(xì)胞內(nèi)的GSH明顯得到下調(diào)，這個(gè)可能是由于脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞后，釋放的L-BSO通過(guò)抑制GCL活性下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)GSH，以及Pt（Ⅳ）前藥的激活消耗GSH，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，提高DSCP/L-BSO Lip的抗腫瘤效果。

圖11 不同制劑處理24 h后胞內(nèi)GSH的定量分析（n＝3）Fig 11 Quantitative analysis of GSH in cells treated with different preparations for 24 h（n＝3）

3 討論

目前而言，順鉑臨床使用過(guò)程中的最大難點(diǎn)是腫瘤耐藥[24-25]。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生順鉑耐藥主要是由于細(xì)胞對(duì)順鉑攝取的降低（例如Ctr1下調(diào)[26]）、外排增加（如ATP7B上調(diào)[27]）、胞內(nèi)順鉑的轉(zhuǎn)化或硫醇物質(zhì)的解毒（如GSH）、DNA修復(fù)（如NER系統(tǒng)[28]）和自噬（如ATG14基因上調(diào)[29]）等因素造成的。在順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，胞內(nèi)的還原物質(zhì)如GSH、甲硫氨酸、金屬硫蛋白、硫氧還蛋白和其他含硫醇的物質(zhì)會(huì)和順鉑發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生Pt（GS）2偶聯(lián)物，進(jìn)而被ATP依賴(lài)性的多藥耐藥相關(guān)蛋白排出細(xì)胞[24-25，30]。大量研究證明，降低胞內(nèi)GSH的濃度，可以恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。近期，Nie課題組構(gòu)建了包載水溶性的Pt（Ⅳ）前藥和蘿卜硫素的納米遞送系統(tǒng)（SFN-CDDP-NPs），通過(guò)蘿卜硫素消耗乳腺癌細(xì)胞GSH的機(jī)制，降低了Pt（GS）2的生成，腫瘤細(xì)胞凋亡大大增加，顯著提高了體內(nèi)腫瘤的治療效果[31]。

脂質(zhì)體是由天然的或人工合成的脂質(zhì)組合形成的封閉囊狀結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性和生物降解性[32-33]。它具有疏水性的脂質(zhì)雙分子層和內(nèi)水相，既能將親脂性藥物包載于磷脂雙分子層，也能將親水性藥物包載在內(nèi)水相[34]。同時(shí)，脂質(zhì)體磷脂雙分子層和DSPE-PEG的疏水段有較好的相似性，易于PEG化修飾，能在脂質(zhì)體表面形成水化層，大大增加藥物的穩(wěn)定性[35]。具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體為水溶性的L-BSO和DSCP的有效共載提供了很好的平臺(tái)。

本文通過(guò)薄膜水化-擠出法制備了DSCP和L-BSO雙載藥的PEG化脂質(zhì)體，對(duì)制備的DSCP/L-BSO Lip進(jìn)行了系統(tǒng)的制劑學(xué)表征，體外抗腫瘤研究也初步證明了DSCP和L-BSO的協(xié)同抗腫瘤作用，DSCP/L-BSO Lip表現(xiàn)出較好的體外抗腫瘤效果，推測(cè)其可能機(jī)制為：① 相對(duì)于DSCP Lip，DSCP/L-BSO Lip攝取入胞后，L-BSO從脂質(zhì)體中釋放出來(lái)，通過(guò)特異性抑制GCL活性，降低了GSH的合成，一定程度增加了抗腫瘤效果；② 和同等劑量的DSCP和L-BSO混合溶液劑相比，DSCP和L-BSO混合溶液劑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的方式是被動(dòng)擴(kuò)散，而對(duì)于DSCP/L-BSO Lip制劑而言，其不僅能通過(guò)內(nèi)吞的方式進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，同時(shí)該脂質(zhì)體中釋放出來(lái)的DSCP和L-BSO也可以通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散方式進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效果。本研究制備的DSCP/L-BSO Lip具有較好的逆轉(zhuǎn)腫瘤順鉑耐藥的治療效果，為鉑類(lèi)新制劑的研發(fā)提供了新的思路。