沉默環(huán)狀RNA hsa_circ_0076535表達對食管鱗癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

楊瀟，胡龍淼

（1.上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院 內(nèi)科，上海 201800；2.國家肝癌科學中心 上海 201800）

食管癌（EC）是一種常見的癌癥類型，其致死率位于全球癌癥死亡的第6 位［1］。食管鱗狀細胞癌（ESCC）是一種由食管上皮細胞誘導的腫瘤，是EC 最常見的疾病亞型［2］。ESCC 具有極高的致死率，Ⅲ期ESCC 患者5 年內(nèi)總生存率僅為10%～15%，Ⅳ期患者的中位生存期<1 年。ESCC 診斷和預后主要面臨該癥狀的晚期出現(xiàn)、內(nèi)窺鏡檢查的成本或不適用、不敏感性及生物標志物的非特異性［1，3］。因此，迫切需要尋找用于ESCC 診斷、治療及預后、新的敏感且成本有效的生物標志物。

環(huán)狀RNA（circRNAs）正在成為非編碼RNA界的新星，是近些年研究癌癥診斷、治療及預后潛在分子靶點的熱門方向［4］。circRNAs 通過連接游離的3'-至5'-末端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與mRNA 或線性非編碼RNA 相比，其具有更高的穩(wěn)定性，且不含RNA 核酸外切酶［5］。circRNAs 不僅存在于細胞內(nèi)，還可以輸出到細胞外發(fā)揮作用［6］。CricRNAs的這一特性使其可以通過進入到血液中作為檢測樣本的生物標志物，更重要的是circRNAs 被證實能夠在特定細胞類型或特定病理條件下表達［7］。此外越來越多的證據(jù)表明，circRNAs 被確認為癌癥的診斷或預后生物標志物，例如膠質(zhì)瘤［8］和喉鱗狀細胞癌［9］等。然而關(guān)于circRNAs 在ESCC 中作為生物標志物的相關(guān)信息仍然需要繼續(xù)探索。有研究表明，circRNA hsa_circ_0076535 在ESCC腫瘤組織內(nèi)表達升高，但是其對ESCC 細胞的影響仍舊未知［10］。本研究通過下調(diào)細胞內(nèi)hsa_circ_0076535 的表達水平觀察其對ESCC 細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，為尋找新型ESCC 腫瘤生物標志物及治療靶標奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

所有原發(fā)性ESCC 腫瘤組織及與之相匹配的正常組織均來自于2016 年1 月至2018 年12 月在上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院接受手術(shù)的ESCC 患者，并通過經(jīng)驗豐富的病理學家確認。所有患者術(shù)前均經(jīng)食管鏡活檢病理學證實為ESCC，且術(shù)前未進行放化療。所有患者簽署書面知情同意書，且該研究得到了醫(yī)院癌癥倫理委員會的批準，所有程序都是按照相關(guān)指南進行。

1.2 方法

1.2.1 細胞株及主要試劑 人ESCC 細胞株Het-1A、Eca109、KYSE170 均來自于美國標準生物品收藏中心（ATCC）。RPMI 1640 細胞培養(yǎng)基購買于南京KeyGen 公司，胰蛋白酶及RIPA 細胞裂解液、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Platinum SYBR Super Mix 試劑及Lipofectamine 2000均購買于美國Invitrogen 公司，PCR 引物購自南京金斯瑞生物科技有限公司。hsa_circ_0076535 干擾siRNA 片段由廣州銳博生物科技公司設(shè)計并合成。Matrigel 基質(zhì)膠購自美國BD 公司，CCK-8 試劑盒購買于北京普洛麥格生物科技有限公司，Transwell小室（孔徑3.0 μm）購買于美國Corning 公司，免疫組織化學試劑盒及DAB 試劑盒均購自于美國R&D Systems。

1.2.2 RNA 提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書從組織及細胞樣本中提取總RNA 分子，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進行PCR 反應對cDNA 進行擴增，以GAPDH作為內(nèi)參。hsa_circ_0076535 及GAPDH PCR 引物序列如下，hsa_circ_0076535 正向引物：5'-GCGCCACTATGCCCAGCTAA-3'，反向引物：5'-GGCTGAGACGGGCAGATCAC-3'。GAPDH 正向引物：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，反向引物：5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3'。所有實驗均重復3 次。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將所有細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基、37℃、5%二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。通過Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將hsa_circ_0076535 的siRNA 干擾片（si-circ）或?qū)φ栈蚱危╯i-NC）轉(zhuǎn)染進KYSE170 細胞內(nèi)，所有操作均按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行，轉(zhuǎn)染24 h 后進行下一步操作。

1.2.4 CCK-8 檢測細胞增殖能力 通過CCK-8 實驗檢測KYSE170 細胞增殖能力，所有步驟均按照試劑盒說明書進行。按照3000 細胞/孔將KYSE170 細胞種植于96 孔板內(nèi)，分別在轉(zhuǎn)染后的0 h、24 h、48 h、72 h 及96 h 對細胞增殖能力進行檢測。在每個96 孔板的孔中均加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃孵育2 h，然后用酶標儀檢測450 nm 條件下溶液的吸光度值。每組實驗均重復3 次。

1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力 取100個轉(zhuǎn)染后的KYSE170 細胞接種于6 孔板培養(yǎng)基上，在6 孔板中加入2 mL 含有10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基。每3 天更換1 次培養(yǎng)基，14 d 后用4%多聚甲醛固定細胞并進行結(jié)晶紫染色，手動計算肉眼可見的克隆數(shù)目。

1.2.6 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 收集對數(shù)生長期的KYSE170 細胞，接種于6 孔板內(nèi)，并在6 孔板的背面劃5 條平行線用作標記，48 h 后用10 μL 槍頭在細胞中劃2 條平行直線，與6 孔板背面的直線垂直。用0.01 M PBS 溶液輕輕漂洗細胞，然后加入2 mL 無胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，分別在0 h、48 h 將培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察細胞向劃痕中間遷移的距離并拍照記錄，每組實驗設(shè)置3 個平行孔，且實驗重復3 次。

1.2.7 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 取轉(zhuǎn)染了si-circ 或si-NC 的對數(shù)生長期KYSE170 細胞種植于Transwell 小室的上室，下室中加入600 μL 含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48 h 后，用棉簽輕輕擦凈上室中的細胞，用0.01 M PBS 溶液清洗后進行結(jié)晶紫染色，將Transwell 小室放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機觀察5 個視野，計算穿膜的細胞數(shù)。本實驗重復3 次。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0076535 在ESCC 組織及細胞內(nèi)高表達情況

分離ESCC 細胞系（Het-1A、Eca109、KYSE170）、ESCC 患者腫瘤組織及相應的癌旁組織內(nèi)總RNA，通過qRT-PCR 對組織及細胞內(nèi)hsa_circ_0076535 的表達水平進行檢測。實驗結(jié)果表明，與Het-1A 細胞相比，Eca109、KYSE170 細胞內(nèi)hsa_circ_0076535 呈現(xiàn)高表達（見圖1A），且在ESCC 患者癌組織內(nèi)同樣顯示高表達（見圖1B）（P<0.05）。hsa_circ_0076535 在ESCC 的發(fā)生過程中可能發(fā)揮著一定作用，然而這種作用目前并不明確。

圖1 hsa_circ_0076535 在ESCC 細胞系及組織內(nèi)的表達水平

2.2 下調(diào)hsa_circ_0076535 能夠抑制ESCC 細胞增殖

設(shè)計并合成si-circ 干擾序列用于體外研究hsa_circ_0076535 對ESCC 細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。將兩種si-circ（si-circ_1#、si-circ_2#）片段及si-NC 片段分別轉(zhuǎn)染進KYSE170 細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48 h 后通過qRT-PCR 對細胞內(nèi)hsa_circ_0076535表達水平進行檢測。如圖2A 所示，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)si-circ_1#具有較好的沉默效果，因此在接下來的實驗中選取si-circ_1#用于干擾目的基因的表達，隨后通過CCK-8 實驗對KYSE170 細胞的增殖活性進行檢測，分別在轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h、72 h 及96 h 時間點檢測細胞在450 nm 時的吸光度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)hsa_circ_0076535 的表達能夠抑制KYSE170 細胞增殖，且抑制效果隨時間的增加而增加（見圖2B）。此外，克隆形成實驗同樣證明下調(diào)細胞內(nèi)hsa_circ_0076535 的表達水平能夠抑制細胞增殖（見圖2C）?？傊ㄟ^CCK-8 及克隆形成實驗證明下調(diào)ESCC 細胞內(nèi)hsa_circ_0076535 的表達水平能夠抑制細胞增殖。

圖2 下調(diào)ESCC 細胞內(nèi)hsa_circ_0076535 的表達水平對細胞增殖的影響

2.3 下調(diào)hsa_circ_0076535 能夠抑制ESCC 細胞遷移、侵襲

為了檢測hsa_circ_0076535 對ESCC 細胞遷移及侵襲能力的影響，在KYSE170 細胞中轉(zhuǎn)染了si-circ 或si-NC 核苷酸片段，通過劃痕愈合實驗及Transwell 實驗來驗證下調(diào)hsa_circ_0076535 對KYSE170 細胞的遷移及侵襲能力的影響。劃痕愈合實驗結(jié)果表明，細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，轉(zhuǎn)染si-circ組細胞的遷移距離明顯小于轉(zhuǎn)染si-NC 組細胞及對照組細胞（P<0.05），下調(diào)hsa_circ_0076535 能夠顯著抑制KYSE170 細胞的遷移能力（見圖3A）。同樣的Transwell 實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了si-circ 的KYSE170 細胞轉(zhuǎn)移至下室中的數(shù)目最少（見圖3B）。綜合上述實驗結(jié)果可知，下調(diào)ESCC 細胞中hsa_circ_0076535 表達水平能夠顯著抑制細胞的遷移及侵襲能力。

圖3 檢測hsa_circ_0076535 對ESCC 細胞遷移及侵襲能力影響的劃痕愈合實驗及Transwell 實驗

3 討論

circRNAs 首次發(fā)現(xiàn)于1976 年的植物中，并被證明能夠編碼亞病毒因子［11］。近些年隨著RNA-seq技術(shù)及生物信息學的發(fā)展，逐漸證明了circRNAs的豐度及多樣性，并在不同的發(fā)育階段和生理條件下揭示了circRNAs 的動態(tài)表達模式，且還發(fā)現(xiàn)了更多circRNAs 的功能，例如在蛋白質(zhì)復合物的組裝中充當支架，調(diào)節(jié)親本基因的表達，充當miRNA 海綿［12-13］。

隨著研究的深入，逐漸積累的證據(jù)表明circRNAs 在許多疾病的發(fā)展過程中扮演著重要的角色［14-15］，由于其具有保守性、豐度及組織特異性的特點，使其可能在某些疾病分子中充當特殊的分子標志物，包括腫瘤［16-17］，例如研究報道環(huán)狀RNA hsa_circ_0014130 可能是潛在的非小細胞肺癌的臨床生物標志物［18］。癌癥是一種復雜的動態(tài)生物學過程，ESCC 也不例外，且多個基因被證明與ESCC 有關(guān)，例如lncRNA 中的NEAT1［19］、HOTAIR［20］等。然而目前還不清楚circRNA 是否與ESCC 相關(guān)。

本研究中證明了hsa_circ_0076535 在ESCC 組織及細胞系內(nèi)高表達，這預示著hsa_circ_0076535可能與ESCC 存在一定的聯(lián)系。筆者利用siRNA技術(shù)干擾ESCC 細胞內(nèi)hsa_circ_0076535 的表達水平，用于研究hsa_circ_0076535 與ESCC 細胞表型的關(guān)聯(lián)。CCK-8 實驗結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染si-NC 組的細胞及對照組細胞相比，轉(zhuǎn)染si-circ 組ESCC 細胞增殖能力顯著下降，且隨時間的增加增殖能力降低更顯著。同樣的克隆形成實驗同樣證明，下調(diào)hsa_circ_0076535 在ESCC 細胞內(nèi)的表達能夠顯著抑制細胞的增殖能力。此外劃痕實驗結(jié)果顯示，下調(diào)hsa_circ_0076535 的表達能夠顯著減小ESCC細胞的遷移距離及抑制細胞遷移。Transwell 實驗結(jié)果同樣顯示，抑制ESCC 細胞內(nèi)hsa_circ_0076535 的表達能夠顯著降低轉(zhuǎn)移的細胞數(shù)目，顯著抑制ESCC 細胞的侵襲能力。

綜上所述，本研究結(jié)果證明，下調(diào)ESCC 細胞內(nèi)hsa_circ_0076535 的表達水平能夠抑制細胞增殖、遷移及侵襲，且本研究首次在ESCC 中闡述了circRNAs 的作用，拓展了ESCC 的認識，并為尋找新的ESCC 潛在生物標志物奠定了基礎(chǔ)。