模擬海洋大氣環(huán)境下生物礦化膜抑制低合金鋼腐蝕行為研究

趙倩玉，惠芯蕊，王亞楠，高珊，張才毅，郭章偉，郭娜，劉濤

（1.上海海事大學，上海 201306；2.寶山鋼鐵股份有限公司，上海 201900）

低合金鋼由于其良好的力學性能，廣泛應用于海洋工程領域，但是其在海洋環(huán)境中極易腐蝕，特別是在海洋大氣區(qū)，因此大氣腐蝕是導致金屬鋼結構失效的重要原因之一[1-3]。大氣腐蝕在不同區(qū)域，具有不同的特性[4-5]。當空氣的相對濕度小于100%時，低合金鋼極易受到腐蝕，這是由于水分在低合金鋼表面凝聚，金屬表面會出現(xiàn)極薄的水膜，空氣中的氧極易通過水膜到達金屬表面，造成金屬的氧去極化腐蝕。當相對濕度為100%時，由于在海水上方，水膜中總是含有溶解的鹽，故低合金鋼的腐蝕是在電解質液膜下進行的，這類腐蝕與全浸于海水中的電化學腐蝕過程類似[6-7]。

為了減少金屬由于大氣腐蝕造成的損失，多位研究者通過現(xiàn)場掛片或實驗室實驗來獲得腐蝕數(shù)據，進而提出改進方法，采取相應的防護措施。目前最主要的防護措施為在材料表面進行涂裝處理[8-9]，涂料將金屬和大氣分隔的同時，涂料中的顏填料還會和金屬發(fā)生化學反應，在金屬表面形成鈍化膜來保護材料。此外，還有人利用超疏水的特性，研制新型的防護材料，從而有效阻止金屬表面液膜/液滴的形成[10]；或者針對性地研發(fā)性能更優(yōu)良的耐候鋼，從根本上對材料作出調整，進行防護[11]。這些措施均可有效改善材料的大氣腐蝕，但是存在著成本較高、對環(huán)境不友好等不足。本文將通過微生物的礦化作用提高低合金鋼的耐大氣腐蝕性能，從而為海洋材料的大氣腐蝕防護提供一種新思路。

筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，由微生物誘導產生的礦化膜在海水中對金屬具有良好的保護作用。微生物會在金屬表面形成一層有機-無機的雜化膜，這種雜化膜與金屬具有良好的結合力，不易剝落[12-13]，且非常致密，可以阻礙氯離子和氧的滲入，使金屬基體免受侵蝕。

筆者課題組之前的研究主要集中在生物礦化膜對海水腐蝕的抑制，但對在海洋大氣中的保護效果并未進行深入探究。大氣腐蝕和海水腐蝕存在一定的差別，其差異性主要源于金屬表面電解質薄液膜的厚度，薄液膜的厚度會影響氧氣到達金屬表面的難易程度[14-15]。于是，基于已有的研究，本文對預形成的生物礦化膜進行了大氣中金屬腐蝕的測試實驗，由此做進一步的探究。

本文使用電化學的方法（電化學阻抗、極化曲線）研究了生物礦化膜在薄液膜下對于低合金鋼的保護效果，并結合掃描開爾文探針測試技術，原位檢測薄液膜腐蝕環(huán)境下生物礦化膜對金屬的保護性能，探究了生物礦化膜在海洋大氣環(huán)境下的腐蝕防護機制。

1 試驗

1.1 樣品制備

本文使用的低合金鋼（EH32）由寶鋼（中國上海）提供。低合金鋼的主要成分為：Mn 1.52%，Cr 0.15%，Ni 0.7%，Al 0.04%，C 0.055%，其余為鐵。樣品用環(huán)氧樹脂封好，留出1 cm×1 cm 的工作區(qū)域，將其用碳化硅砂紙從120 目逐級打磨至1000 目，然后用酒精清洗，再放入超聲儀中超聲10 min，去除表面雜質。最后，用去離子水清洗樣品表面，并氮氣吹干，放置于紫外下照射滅菌30 min，備用。

1.2 細菌培養(yǎng)

本文用于制備生物礦化膜的細菌為一種假交替單胞菌（P. lipolytica），由中科院南海所王曉雪研究員提供。用接種針將得到的菌株從固體培養(yǎng)基上轉接到 2216E 液體培養(yǎng)基錐形瓶中，放置于 37 ℃、120 r/min 的搖床上培養(yǎng)24 h，使菌液濃度達到5×106CFU/mL。培養(yǎng)基的主要成分為：1.0 g/L 酵母提取物，5.0 g/L 蛋白胨，0.1 g/L 檸檬酸鐵，19.40 g/L NaCl，5.90 g/L MgCl2，3.24 g/L Na2SO4，1.80 g/L CaCl2，0.55 g/L KCl，0.16 g/L Na2CO3，0.08 g/L SrBr2，0.08 g/L KBr，0.034 g/L SrCl2，0.022 g/L H3BO3，0.004 g/L NaSiO3，0.0024 g/L NaF，0.0016 g/L NH4NO3和0.008 g/L Na2HPO4。

1.3 生物礦化膜的制備

向裝有200 mL 滅菌后的2216E 液體培養(yǎng)基中接入100 μL 擴培后的菌液，將滅菌備用的樣品浸入其中，放置于37 ℃、120 r/min 搖床上培養(yǎng)7 d，每隔3 d 更換一半2216E 液體培養(yǎng)基。7 d 后，將表面形成礦化膜的樣品取出，用去離子水清洗，并氮氣吹干，放入干燥箱保存，以便進行后續(xù)實驗。

1.4 液膜電化學測試

生物礦化膜在薄液膜下的三電極電化學測試裝置如圖1 所示，薄液膜的厚度主要由歐姆表螺旋調節(jié)器和一根銅針進行調節(jié)控制。當銅針和液膜接觸時，歐姆表上的針就會跳動。該裝置的精確度為10 μm。薄液膜所處環(huán)境的相對濕度和溫度分別控制在70%、25 ℃。另外，裝置中配有一個加濕器，以避免液膜厚度發(fā)生變化。

將液膜調節(jié)到指定厚度后，使用電化學方法測試了礦化膜對金屬的保護性，使用AutoLab 電化學工作站（Metrohm, Switzerland）測試了不同液膜厚度下的陰極極化曲線和不同浸泡時間下的電化學阻抗譜（EIS）。低合金鋼作為工作電極，鉑片作為對電極，飽和甘汞電極作為參比電極。在測量電化學阻抗譜之前，對樣品的OCP 進行至少30 min 的監(jiān)測，以達到穩(wěn)定狀態(tài)。EIS 測量的頻率范圍為0.01～1×105Hz，交流激勵信號峰值為±5 mV。陰極極化曲線的電位掃描范圍從開路電位到–1.7 V。最后使用Zsimpwin 軟件來擬合電化學阻抗數(shù)據。實驗所使用的電解質溶液為去離子水和純NaCl 配制的5%中性NaCl 溶液。因為大氣液膜中的鹽度更大，條件也更苛刻，所以在5%時腐蝕最嚴重。

1.5 生物礦化膜宏觀觀察與掃描開爾文探針（SKP）測試

掃描開爾文探針技術目前已廣泛應用在大氣腐蝕機理的研究中，是一種分辨率達納米級的微區(qū)電化學測試技術。通過該技術可以得到金屬表面的電偶電位差，從而判斷金屬表面的局部腐蝕傾向[16-18]。本實驗中，生物礦化膜在50 μm 薄液膜環(huán)境中長期浸泡，分別在1 h 及1、12、24、30 d 時，將樣品取出，使用數(shù)碼相機進行拍照，并使用SKP（Bio-logic M470，F(xiàn)rance）測試樣品表面的電位變化。使用SKP 掃描樣品表面，掃描范圍為6 mm×2 mm，探針振幅為30 μm，探針到樣品表面的距離保持在100 μm，掃描的步長為50 μm，且所有SKP 測試均在室溫下進行。探針與生物礦化膜之間的電位差Vkp與腐蝕金屬電極的腐蝕電位Ecorr具有線性關系：Ecorr=Vkp+C（C為常數(shù)項，可通過實驗確定）。由測得的Vkp可得出生物礦化膜在鹽霧中電位差的變化規(guī)律[19-22]。

1.6 表面形貌及成分分析測試

采用原子力顯微鏡（AFM）測定生物礦化膜的晶體結構分析，掃描頻率為 0.977 Hz，掃描面積為600 nm×600 nm，扭矩為0.4 N/m。在Scan Asyst 模式下，使用Si3N4探針進行測試。此外，利用高分辨透射電子顯微鏡對細菌誘導的礦物進行分析。在分析之前，將0.1 mL 培養(yǎng)14 d 的P. lipolytica菌液放置在銅網上。使用10 μm 的孔徑選定區(qū)電子衍射（SAED）模式對一個直徑大約0.2 μm 的圓形區(qū)域進行分析。使用掃描電子顯微鏡（SEM, JEOL JSM-7500 F）對腐蝕后的生物礦化膜進行表征，觀察樣品表面和截面的腐蝕形貌。利用傅里葉紅外光譜（FTIR，Vertex 70,Bruker, Germany）對未浸泡和薄液膜浸泡30 d 后的生物礦化膜表面的官能團進行分析[23]，掃描范圍為400～4000 cm?1。使用ACE Recommended Pratice 0775-1999 Protocol（NACE, 1999）的方法去除樣品表面的生物礦化膜和腐蝕產物[24]。將樣品依次浸入鹽酸-氮氮二丁基硫脲溶液、飽和NaHCO3溶液和去離子水中（各2 min），利用3D 光學輪廓儀（Bruker，Germany）對鋼的表面形貌進行觀察。此外，對形成生物礦化膜的試樣表面進行 XRD 測試（PANalytical X′Pert PRO XRD，40 kV，10 mA，Cu-Kα 輻射源，掃描范圍為2θ=10°～90°），進行物相鑒定。

2 結果及分析

2.1 表面形貌及成分分析

為了證明P. lipolytica菌株形成的生物礦化膜結構，在第24 d 對金屬試樣表面形成的生物礦化膜進行了多個位置的橫截面掃描和原子力顯微鏡（AFM）成像。由圖2a 可以看出，樣品表面生物礦化膜的厚度約為43 μm，并且膜和金屬基體之間的界面是緊密閉合的。AFM 圖像顯示，礦化膜為均勻致密的山丘狀，其粗糙度大約為650 nm（見圖2b）。對P. lipolytica細胞的TEM 分析表明，有納米級大小的礦化產物（直徑約為200～400 nm）嵌入附著在細菌細胞壁上的EPS中（見圖2c）。根據SAED 圖，筆者認為這些納米級的礦化產物為多晶碳酸鈣鎂鹽和非晶結構胞外多糖的混合物（見圖 2d）。通過高分辨透射電鏡（HRTEM）分析表明，礦化產物為至少3 個晶面的多晶結構。礦化產物的晶面間距分別為 0.25、0.30、0.38 nm，對應于(110)、(104)和(012)晶面（見圖2e）。試樣表面XRD 的測試結果（圖2f）表明，Mg.064Ca.936CO3是其表面的主要成分，與圖2d 的結果相對應。

浸泡14 d 后，形成生物礦化膜的樣品及其在50 μm 液膜條件下腐蝕24、30 d 的表面形貌如圖3所示。圖3a 為生物礦化膜未腐蝕時的表面形貌，可以看到樣品表面非常致密，并且有很多三角形結構的晶體緊密相連。當生物礦化膜在薄液膜下浸泡24 d后（見圖3b），雖然此時生物礦化膜表面出現(xiàn)了一些缺陷，但仍然為很多三角形結構的物質相互交聯(lián)在一起。在薄液膜下浸泡30 d 后（見圖3c），金屬表面三角形結構部分消失。這可能是由于樣品表面礦化膜中的碳酸鹽與空氣中的二氧化碳、水發(fā)生了反應，礦化膜中不溶性的碳酸鈣鎂鹽變成了微溶性的碳酸氫鹽，礦化膜發(fā)生了溶解現(xiàn)象，之前出現(xiàn)的小孔被疏松的腐蝕絮狀物所覆蓋、填充。因此，在薄液膜下浸泡30 d 后，生物礦化膜的防護性能可能會下降。樣品表面礦化膜和腐蝕產物共存，由于薄液膜極薄，腐蝕產物并未在薄液膜溶液中剝離，而是填充在生物礦化膜的空隙中。

由圖4 的光學輪廓圖可以看到，在薄液膜下浸泡24 d（見圖4a），去除腐蝕產物膜以后，低合金鋼的表面未受到明顯的腐蝕，且未出現(xiàn)明顯的點蝕，說明此時生物礦化膜依然可以保護金屬免受侵蝕。在薄液膜下浸泡30 d 后（見圖4b），低合金鋼表面出現(xiàn)了明顯的點蝕坑，最深達到了26 μm，說明生物礦化膜的防護效果下降。對比沒有形成生物礦化膜的樣品去除腐蝕產物后的光學輪廓圖（圖4c），其腐蝕程度是相對較輕的。

形成生物礦化膜的樣品在薄液膜下浸泡30 d 后的FTIR 圖見圖5。從指紋譜圖可以看出，生物礦化膜中方解石的特征峰主要是V2、V3、V4，其峰值分別為876、1426、712 cm–1。1426 cm–1V3的振動峰源于有機質和無機礦物的振動重疊，故沒有振動峰V2、V4的峰值那么尖銳[25]。在紅外光譜中觀察到有機物的振動峰，1690 cm–1處的峰值代表羧酸的C=O 振動，2520 cm–1處的峰值為羧酸中—OH 的伸縮振動，在2500～3000 cm–1內觀察到有機物的C—H 伸縮振動，3429 cm–1的峰值是由于O—H 的振動[26-27]。這些結果表明，該生物礦化膜是由有機質和方解石組成的有機-無機雜化膜。從圖5 中還可以看出，生物礦化膜在薄液膜下浸泡30 d 后，羧酸的C=O 振動峰幾乎消失。—OH 伸縮振動峰、有機物中的C—H 伸縮振動峰的峰值，明顯比未在薄液膜下浸泡的生物礦化膜的振動峰小。這表明生物礦化膜中的有機物隨著時間的增長，逐漸溶解在了薄液膜中。同時結合SEM圖可知，礦化膜中的碳酸鈣鎂鹽也發(fā)生了溶解。故此時的礦化膜無法再隔絕薄液膜溶液中的Cl–和氧氣，Cl–和氧氣通過有機物溶解的縫隙到達金屬表面，造成了金屬的腐蝕。

圖5 生物礦化膜在薄液膜下浸泡30 d 后的FTIR 圖Fig.5 FTIR diagram of biomineralized film soaked for 30 days in thin liquid film

2.2 生物礦化膜在薄液膜下的電化學分析

形成生物礦化膜的樣品在不同液膜厚度下浸泡30 min，電位穩(wěn)定后的陰極極化曲線如圖6 所示。由于陽極極化會引起工作電極的溶解，從而明顯改變薄液膜，因此樣品在薄液膜下的腐蝕速率主要受陰極反應影響。當液膜很薄時，電流會富集在電極邊沿，導致電流分布不均，從而影響試驗結果[28-29]。對于金屬的腐蝕，陰極反應主要為氧還原反應。因此，研究薄液膜下生物礦化膜對金屬的保護性能主要是利用陰極極化曲線，判斷氧氣是否經擴散的方式通過了生物礦化膜到達低合金鋼表面，使金屬發(fā)生氧的還原反應，從而使金屬遭到破壞。由圖6 的極化曲線圖中可以看出，礦化膜在液膜厚度為50 μm 時，腐蝕電流密度最大，而在其他液膜厚度下，腐蝕電流密度差別不大，說明礦化膜在液膜厚度為50 μm 時受到氧的去極化作用最為嚴重。因此，選擇液膜厚度為50 μm。

陰極極化曲線研究的是腐蝕最初行為，不能對生物礦化膜長時間的保護性能進行檢測，而電化學阻抗譜采用較小的擾動電位，對于電化學過程造成的影響是可以忽略的，因此電化學阻抗測試成為了研究薄液膜下長期腐蝕的重要監(jiān)測手段。在薄液膜下，EIS 可以克服溶液歐姆下降的問題，從而得到更加準確的結果。同時根據電化學阻抗譜，不僅可以獲得金屬腐蝕速率的信息，還可研究腐蝕過程和腐蝕機理。

圖6 生物礦化膜在不同液膜厚度下的陰極極化曲線Fig.6 Cathodic polarization curves of biomineralized membranes at different liquid film thicknesses

覆蓋有生物礦化膜的低合金鋼在薄液膜下的阻抗譜隨時間的變化如圖7 所示。圖7a 的電化學阻抗圖譜顯示，在高頻和中低頻分別出現(xiàn)了一個容抗弧。高頻區(qū)一般對應電極表面過程——非法拉第過程，其與生物礦化膜的電容和電阻有關。中低頻區(qū)一般對應電化學過程，與電荷轉移有關?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著浸泡時間的延長，生物礦化膜在薄液膜溶液中的容抗弧逐漸變小。這個反應的等效擬合電路為Rs(QfRf)(QdlRct)，如圖7b 所示。從阻抗擬合數(shù)據（表1）可以看出，礦化膜樣品剛浸入液膜1 h 時，礦化膜在液膜中還未穩(wěn)定，隨著時間的延長，礦化膜的穩(wěn)定性逐漸增強，因此膜電阻上升。繼續(xù)浸泡，液膜中的氯離子和氧氣慢慢滲入礦化膜，礦化膜防護性減弱，因此膜電阻和電荷轉移電阻（Rct）逐漸減小。第1 天，Rf為2.3×104?·cm2，Rct為4870 ?·cm2；第24 天，Rf為1.32×104?·cm2，Rct為695 ?·cm2。電阻逐漸減小，說明生物礦化膜屏蔽效果在24 d 后逐漸下降，但是從掃描電鏡圖中可知，生物礦化膜在薄液膜下浸泡24 d 后，仍然具備較好的保護效果。第30 天，Rf為1.2×104?·cm2，Rct為731 ?·cm2，與24 d 相比，Rf和Rct都有所下降，說明生物礦化膜在30 d 的防護效果減弱，與SEM 和FTIR 結果相符。

圖7 生物礦化膜在液膜厚度為50 μm 時的EIS 和等效電路Fig.7 (a) Nyquist diagrams of the biomineralized film when the liquid film thickness is 50 μm and the (b) equivalent circuit diagram

表1 生物礦化膜在液膜厚度為50 μm 時EIS 隨時間的擬合數(shù)據Tab.1 Fitting data of EIS over time for a biomineralized film with a liquid film thickness of 50 μm

2.3 生物礦化膜的宏觀照片及其SKP 測試結果分析

圖8 在薄液膜下浸泡1 h 及1、12、24、30 d 后樣品的電位分布和宏觀形貌Fig.8 Samples corresponding potential distribution and morphology of the biomineralized film after immersed in the thin liquid film for 1 h and 1, 12, 24, 30 d

形成生物礦化膜的樣品在液膜厚度為50 μm 時浸泡不同時間后，生物礦化膜的形貌如圖8 所示。由圖8 可以看出，隨著浸泡時間的增長，截止到24 d，在樣品表面用肉眼并不能觀察到明顯的腐蝕產物。與樣品實拍圖所對應的SKP 結果顯示，在鹽霧試驗進行到第12 d 時，生物礦化膜的伏打電位差是相近的，約為–0.16 V。根據伏打電位差Vkp與腐蝕金屬電極的腐蝕電位Ecorr的線性關系Ecorr=Vkp+C得出，Vkp越大，Ecorr也就越大。此時負電位差較小，故腐蝕電位很低，不易發(fā)生腐蝕，這與電化學結果一致。電化學阻抗圖中，1～12 d 的電化學阻抗值是相近的，說明生物礦化膜對金屬起到了很好的保護作用，保護金屬免受腐蝕介質的侵蝕。從12～24 d，樣品表面的伏打電位差由–0.16 V 降低至–0.2 V，說明隨著時間的增加，生物礦化膜的防護性能下降，但依然對金屬有很好的保護效果。從24～30 d，生物礦化膜的伏打電位差由–0.2 V降低至–0.45 V，腐蝕電位也進一步負移。從第30 d的實拍圖中可以看出，金屬表面出現(xiàn)了肉眼可見的腐蝕產物。說明此時生物礦化膜中的部分有機物已經完全溶解，生物礦化膜已經出現(xiàn)了明顯的缺陷，腐蝕介質通過缺陷到達了金屬表面。缺陷處的金屬基體作為腐蝕反應的陽極，陰極區(qū)發(fā)生氧還原反應，金屬被腐蝕，此時生物礦化膜也就不再具有保護作用。

近年來，生物膜抑制腐蝕的作用引起了廣泛的關注。微生物形成的生物膜可以抑制金屬腐蝕過程，包括E.coil、Shewanella oneidensis、Bacillus spp.、Pseudomonas spp.、Pseudoalteromonas spp.和Vibrio neocaledonicus。然而，由于生物膜易于分散和溶解，生物膜防腐的持久性仍然是一個重要問題。在本研究中，通過鋼樣表面的形貌表征和腐蝕性能評價，證明了海洋細菌P. lipolytica菌株對樣品具有抑制大氣腐蝕的作用。這是因為，生物礦化膜的層次結構包括具有不同取向的細長棱柱狀晶體，這種晶體有助于減少Cl–或O2的擴散。這種礦化膜一旦離開細菌環(huán)境，缺乏自我修復能力，隨著在薄液膜下長時間的浸泡，礦化膜會發(fā)生一定程度的損害，這是后續(xù)研究中需要進一步改進的。

3 結論

1）P. lipolytica菌可在金屬表面誘導形成生物礦化膜，該膜具有有機-無機雜化結構，其主要成分為方解石結構的碳酸鈣鎂鹽。

2）帶有生物礦化膜的低合金鋼樣品在50 μm 薄液膜下浸泡24 d，由于礦化膜的屏蔽作用，可以將金屬與腐蝕介質隔離，因而得到良好的保護。

3）由宏觀照片和SKP 的測試結果可知，生物礦化膜在前24 d 可以保護金屬免受腐蝕介質的侵蝕，但在30 d 后，礦化膜表面出現(xiàn)了缺陷，伏打電位差變大，使得溶液中的氯離子可以滲入到金屬表面，造成一定的腐蝕。