β-葡萄糖苷酶活性穩(wěn)定化技術(shù)在柑橘產(chǎn)品增香中的應(yīng)用

張晨,賈蒙,馬亞琴

(西南大學(xué)柑桔研究所,國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心,重慶,400712)

柑橘是全世界種植面積最廣且最為重要的水果品種之一,素有“水果之王”的美譽(yù)[1]。據(jù)資料顯示,2018年中國(guó)柑橘產(chǎn)量為4 138.1萬(wàn)t[2]。因受消費(fèi)習(xí)慣和柑橘品種分布及產(chǎn)量的影響,我國(guó)各柑橘加工產(chǎn)品所占比例存在較大差異。近年來(lái)以柑橘罐頭進(jìn)出口量占果蔬罐頭比重較高,而盡管我國(guó)柑橘汁消費(fèi)比例較低,但其進(jìn)口量卻呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì),2018年,達(dá)到了約為9.7×104t[3]的歷史新高。繼果汁和橘瓣罐頭之后,柑橘果酒憑借著其獨(dú)特的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)保健功能逐步引起了消費(fèi)者的青睞,對(duì)柑橘加工產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)特別是增香技術(shù)的研究及優(yōu)化成為企業(yè)和研究人員的關(guān)注熱點(diǎn)。

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)又稱(chēng)β-D葡萄糖苷水解酶,在增香領(lǐng)域具有潛在優(yōu)勢(shì),于1837年首次在苦杏仁汁中發(fā)現(xiàn)[4],隨后陸續(xù)在自然界多種生物體及一些尚未定義的物種中均有發(fā)現(xiàn)。所有的生物體內(nèi)幾乎都存在著β-葡萄糖苷酶,但其在不同的生物體中結(jié)構(gòu)與組成不同[5]。它在微生物領(lǐng)域中作為一種重要的纖維素酶類(lèi),可應(yīng)用于纖維素材料的生物降解和生物轉(zhuǎn)化過(guò)程當(dāng)中。此外,β-葡萄糖苷酶還在生物體的糖代謝途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,可以水解結(jié)合于末端、非還原性的β-D葡萄糖苷鍵并釋放出β-D葡萄糖與相應(yīng)的配基[6]。近年來(lái),針對(duì)β-葡萄糖苷酶可以切斷糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)中配基與糖基之間的糖苷鍵并釋放出香氣的特性被逐漸應(yīng)用到食品的增香領(lǐng)域中。糖苷結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的研究起源于1969年FRANCIS等[7]對(duì)玫瑰花瓣中糖苷形式單萜醇進(jìn)行的檢測(cè)與研究。1993年進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)C13去甲基類(lèi)異戊二烯揮發(fā)性化合物幾乎都源于糖苷前體物衍生,糖苷結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的研究引起了科研人員的關(guān)注[8]。此后,人們對(duì)糖苷類(lèi)芳香化合物的研究迅速增多,包括葡萄、茶、柑橘等。其中對(duì)于柑橘而言,β-葡萄糖苷酶不僅能夠增加柑橘汁中香氣物質(zhì)的種類(lèi)和含量[9],同時(shí)還可以和α-L-鼠李糖苷酶組成柚苷酶用于水解柑橘類(lèi)果實(shí)當(dāng)中重要的苦味物質(zhì)柚皮苷,已有研究?jī)?yōu)化了柚苷酶對(duì)柑橘類(lèi)果汁的最佳脫苦工藝且脫苦效果理想[10]。但對(duì)于β-葡萄糖苷酶的活性而言,柑橘加工過(guò)程中所處環(huán)境的pH,乙醇、葡萄糖、溫度等都極大的限制了β-葡萄糖苷酶的活性進(jìn)而影響了其增香效果。

為了提高β-葡萄糖苷酶在柑橘加工所處復(fù)雜環(huán)境下的活性及穩(wěn)定性,更好地滿(mǎn)足消費(fèi)者對(duì)柑橘加工產(chǎn)品品質(zhì)的要求,本文從β-葡萄糖苷酶的酶活性測(cè)定及增香和脫苦原理出發(fā),進(jìn)而綜述了其在柑橘加工所處復(fù)雜環(huán)境中活性穩(wěn)定化技術(shù)方面的研究現(xiàn)狀,并展望了不同技術(shù)的應(yīng)用前景。

1 β-葡萄糖苷酶的酶活力測(cè)定方法

酶活力測(cè)定方法與β-葡萄糖苷酶在柑橘加工過(guò)程中活性穩(wěn)定化技術(shù)的研究緊密相聯(lián)。選取一種適合的酶活測(cè)定方法不僅可以在酶活性穩(wěn)定化技術(shù)研究中快速、準(zhǔn)確地測(cè)定出相應(yīng)酶活力,并且具有著較好的重現(xiàn)性。

目前,β-葡萄糖苷酶測(cè)定方法主要有以水楊苷為底物的分光光度法、以4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(3-methylumbelliferyl-β-D-glucopyranoside，4-MUG)為底物的熒光法[11]及以對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖苷(4′-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)為底物的比色法[12]。其中,分光光度法由于其適合檢測(cè)酶解底物產(chǎn)生極微量的葡萄糖,故酶解底物過(guò)程中伴有的其他物質(zhì)將容易影響其測(cè)定結(jié)果,檢測(cè)靈敏度較差[13]。相比于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作繁瑣以4-MUG為底物的熒光法而言,以pNPG為底物的比色法因其在實(shí)驗(yàn)中具有簡(jiǎn)易的操作方式,較好的重現(xiàn)性及其快速,準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果而更為常用,但其兩者酶解產(chǎn)物均可能受到一些與它們具有相同吸收波長(zhǎng)物質(zhì)的干擾,如具有藍(lán)色背景的生物樣品容易與4-MUG熒光法酶解產(chǎn)物的藍(lán)色熒光發(fā)生重疊現(xiàn)象,pNPG比色法酶解后生成的黃色對(duì)硝基苯酚與柑橘汁及柑橘酒顏色相近,從而可能會(huì)影響400 nm左右對(duì)硝基苯酚的吸光度[14-15]。因此,當(dāng)進(jìn)行柑橘中β-葡萄糖苷酶酶活力測(cè)定過(guò)程中存在生色團(tuán)干擾時(shí),還可以通過(guò)測(cè)定其釋放出的葡萄糖及釋放出的酚類(lèi)物質(zhì)含量來(lái)計(jì)算其酶活力[16]。近期,WANG等[17]基于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)原理建立了一種以2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸為底物的β-葡萄糖苷酶酶活力測(cè)定方法,其因檢測(cè)波長(zhǎng)短于以pNPG為底物的比色法和以4-MUG為底物的熒光法而能有效避免部分體系在高于400 nm范圍內(nèi)的干擾,此為不同實(shí)際檢測(cè)體系中β-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定提供了新的選擇方案。表1是不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的一些基本性質(zhì)。

表1 不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的基本性質(zhì)Table 1 The basic properties of β-glucosidase from different sources

2 β-葡萄糖苷酶的增香及脫苦原理

香氣影響著柑橘加工產(chǎn)品的品質(zhì),在柑橘加工過(guò)程中產(chǎn)品的脫苦和增香相輔相成,是加工技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。β-葡萄糖苷酶酶解前后,紅橙果汁中酸類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)在種類(lèi)和含量上均有所上升,并基于果汁原有風(fēng)味的基礎(chǔ)上增添了安息香醛、3-蒈烯等風(fēng)味物質(zhì),進(jìn)而在感官評(píng)定表中顯示果汁樣品分值提升,表明β-葡萄糖苷酶在果汁的口感及風(fēng)味方面具有良好的增香效果[9]。

柑橘的香氣物質(zhì)由可被人們感知到的游離態(tài)香氣物質(zhì)和只有經(jīng)過(guò)酸解或酶解釋放后才可以被人們感知到的以糖苷形式存在,且不具有揮發(fā)性的糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)所組成。其中較為重要的鍵合態(tài)香氣物質(zhì)是以萜烯類(lèi)物質(zhì)、C13降異戊二烯類(lèi)物質(zhì)及苯的衍生物為配基的糖苷鍵合態(tài)物質(zhì),β-葡萄糖苷酶能夠水解糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)中配基與糖基之間的糖苷鍵,從而達(dá)到增香的目的,若水解過(guò)程中糖苷與雙糖連接,則需要α-L-鼠李糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶或β-木糖苷酶等外切酶對(duì)其外糖切割以后,再由β-葡萄糖苷酶切割釋放糖苷配體,水解過(guò)程如圖1所示。

圖1 糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的水解過(guò)程Fig.1 Hydrolysis of glycoside bound aroma compounds

此外,柑橘的脫苦同樣也是柑橘增香過(guò)程中的關(guān)鍵,“后苦”現(xiàn)象是在柑橘果實(shí)經(jīng)過(guò)放置或加工過(guò)程中產(chǎn)生的,嚴(yán)重影響產(chǎn)品的口感和風(fēng)味,并掩蓋了產(chǎn)品本身及其在加工過(guò)程中所產(chǎn)生的香味。柑橘中的苦味物質(zhì)主要分為兩大類(lèi),黃烷酮糖苷類(lèi)化合物和三萜類(lèi)化合物,柚皮苷和檸檬苦素分別為兩者的代表性物質(zhì),且相比于柚皮苷而言,檸檬苦素苦味閾值很低,苦味約為柚皮苷苦味的20倍[26-27]。但檸檬苦素主要分布于果實(shí)的種子中[28],可以通過(guò)去除種子的方式使檸檬苦素類(lèi)似物對(duì)柑橘苦味的影響程度大為降低。因此對(duì)于柚汁及一般帶皮榨汁的柑橘類(lèi)果實(shí)而言,柚皮苷為苦味的主要來(lái)源,利用柚苷酶酶解柚皮苷可脫苦,1938年首次在芹菜種子中分離得到柚苷酶[29],由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成。柚皮苷首先被α-L-鼠李糖苷酶水解為櫻桃苷和鼠李糖,其次在β-D-葡萄糖苷酶的作用下櫻桃苷生成無(wú)苦味的柚皮素和葡萄糖,水解過(guò)程如圖2所示。

圖2 柚皮苷在柚苷酶作用下水解過(guò)程Fig.2 Hydrolysis of naringin under the action of naringinase

3 β-葡萄糖苷酶提高柑橘加工產(chǎn)品香氣的應(yīng)用

β-葡萄糖苷酶酶制劑的純度、產(chǎn)量、活性及穩(wěn)定性對(duì)柑橘加工產(chǎn)品的香氣至關(guān)重要,直接影響著柑橘在加工過(guò)程中糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)水解效率的高低及脫苦效果。柑橘在加工過(guò)程中β-葡萄糖苷酶的活性、穩(wěn)定性容易受到加工條件的影響導(dǎo)致增香效率的降低。目前,已有相關(guān)研究人員綜述了葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中如何提升β-葡萄糖苷酶的活性及穩(wěn)定性[30],但在柑橘加工所處復(fù)雜環(huán)境中β-葡萄糖苷酶活性穩(wěn)定化技術(shù)研究較少,故可選用微生物產(chǎn)酶的方式、酶的固定化技術(shù)、釀酒酵母表面展示技術(shù)及酶的半理性設(shè)計(jì)技術(shù)來(lái)提高β-葡萄糖苷酶在柑橘加工所處復(fù)雜環(huán)境中的活性及穩(wěn)定性,進(jìn)而提升其在柑橘加工過(guò)程中的增香效率。

3.1 微生物產(chǎn)酶

目前,由于微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶酶活性、穩(wěn)定性普遍高于植物的,故為采用微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶[31-32]。近年來(lái),針對(duì)柑橘在釀酒過(guò)程中缺乏專(zhuān)用的酵母菌株造成柑橘果酒風(fēng)味不佳,研究人員在柑橘專(zhuān)用酵母菌株篩選方面的研究日益增多,其中菌株的釀酒特性、揮發(fā)性物質(zhì)濃度、氣味活性值、感官評(píng)價(jià)得分均作為柑橘酒發(fā)酵候選品種篩選的關(guān)鍵指標(biāo)[33]。

在柑橘果酒發(fā)酵過(guò)程中,相比于有些可以產(chǎn)生豐富β-葡萄糖苷酶的非釀酒酵母而言[34],由于釀酒酵母普遍不具備合成β-葡萄糖苷酶的能力而導(dǎo)致柑橘果酒經(jīng)商業(yè)釀酒酵母菌株發(fā)酵后風(fēng)味不佳[35]。非釀酒酵母菌菌株與釀酒酵母菌菌株聯(lián)合發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣物質(zhì),特別是高級(jí)醇和酯類(lèi)物質(zhì)含量高,有利于改善柑橘酒的感官品質(zhì)[36]。對(duì)此,HU等[37]為篩選適合柑橘酒發(fā)酵的非釀酒酵母菌菌株,采用理化方法和固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)10株非釀酒酵母菌菌株的釀酒特性和揮發(fā)性組分進(jìn)行了研究,并選擇了揮發(fā)性物質(zhì)濃度、氣味活性值、感官評(píng)價(jià)得分均較高的Hanseniasporauvarum、Hanseniasporaopuntiae、Hanseniasporaoccidentalis、Pichiakudriavzevii及Torulasporadelbrueckii作為柑橘酒發(fā)酵的候選品種。而對(duì)葡萄酒中微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶增香效果研究時(shí)發(fā)現(xiàn),微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶在葡萄酒生產(chǎn)當(dāng)中具有較高的穩(wěn)定性,且經(jīng)過(guò)β-葡萄糖苷酶處理的葡萄酒中萜烯濃度高于未經(jīng)處理的葡萄酒,萜烯酚作為葡萄酒中賦予新鮮果香的主要單萜類(lèi)物質(zhì)之一[38],其含量比未經(jīng)處理的對(duì)照組顯著增加了約27倍[39]。但柑橘酒方面還鮮有文獻(xiàn)能夠像對(duì)葡萄酒中微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶增香效果進(jìn)行研究,原因可能在于柑橘酒脫苦工藝的不完善導(dǎo)致脫苦效果不理想且柑橘汁糖分較低,不利于自然發(fā)酵等,因此需深入分析并評(píng)估其在柑桔產(chǎn)品中的增香效果。

3.2 β-葡萄糖苷酶的固定化

β-葡萄糖苷酶的固定化是指將酶限制于一定區(qū)域內(nèi)仍可保留其催化活性并可重復(fù)回收使用的一項(xiàng)技術(shù),其中β-葡萄糖苷酶不僅作為一種高效的糖苷水解催化劑,而且作為柚苷酶的重要組成部分,在柑橘果汁的脫苦方面也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。因此,良好載體的篩選既可以拓寬固定化后β-葡萄糖苷酶pH值和活化溫度范圍,并且可使固定化后的柚苷酶在酸性pH和低溫條件下的活性最適,從而使其在保持橙汁營(yíng)養(yǎng)和感官特性的前提下適用于柑橘汁等酸性環(huán)境,這對(duì)于更好地提升柑橘加工產(chǎn)品的香氣及柚子汁脫苦效果的改善具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[40-41]。近期,β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性隨著新型固定化材料Eupergit C的發(fā)現(xiàn)得到了很大的提升,且可以耐受酒精度為18%、pH<3.0及葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L的溶液[42],相對(duì)于葡萄酒所處發(fā)酵環(huán)境相似的柑橘酒而言,新型材料Eupergit C的發(fā)現(xiàn)基本克服了β-葡萄糖苷酶在柑橘加工產(chǎn)品中應(yīng)用的壁壘。此外,將柚苷酶固定在經(jīng)過(guò)戊二醛活化的殼聚糖微球上對(duì)柚子汁進(jìn)行脫苦時(shí),柚子汁的脫苦效果和感官品質(zhì)均得到了較大改善[45]。

3.3 釀酒酵母表面展示技術(shù)

固定化技術(shù)為保持酶的穩(wěn)定性提供了一條有前景的途徑,但固定材料的高成本和復(fù)雜的純化過(guò)程阻礙了其大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用。細(xì)胞表面展示技術(shù)可以避免繁瑣的純化和固定化過(guò)程,使表達(dá)的多肽以融合蛋白的形式展現(xiàn)在核糖體、病毒或細(xì)胞表面進(jìn)而篩選、進(jìn)化具有優(yōu)良特性的基因編碼肽分子。

釀酒酵母表面展示系統(tǒng)的步驟是將釀酒酵母細(xì)胞壁蛋白與目標(biāo)蛋白融合,然后由胞壁蛋白通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵形式連接在細(xì)胞壁上。ZHANG等[43]為評(píng)估細(xì)胞表面展示技術(shù)在葡萄酒增香領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力,利用不同的啟動(dòng)子(GPD和SED1)和糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定區(qū)(Sag1、SED1和Cwp2)在釀酒酵母的細(xì)胞表面構(gòu)建了β-葡萄糖苷酶顯示系統(tǒng),并對(duì)典型釀酒條件下顯示的β-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性及其在發(fā)酵結(jié)束時(shí)作為全細(xì)胞生物催化劑水解糖苷的能力做了研究,研究結(jié)果表明與商業(yè)酶相比,顯示的β-葡萄糖苷酶不僅在pH 3.0和葡萄糖質(zhì)量濃度低于25 g/L時(shí)均可表現(xiàn)出較高活性,而且具有更好的釋放游離萜醇的能力。因此,相比于傳統(tǒng)固定化技術(shù)而言,其優(yōu)勢(shì)是可以在其表面形成與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相類(lèi)似的保護(hù)層,當(dāng)把β-葡萄糖苷酶展示在釀酒細(xì)胞表面時(shí),不僅降低了葡萄糖對(duì)GH3家族β-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,并且增加了酶的穩(wěn)定性[44-45]。由于柑橘酒所處的發(fā)酵環(huán)境與葡萄酒所處發(fā)酵環(huán)境相似,因此表面展示系統(tǒng)對(duì)于提升柑橘加工產(chǎn)品香氣方面提供了新的可行性解決方案。

3.4 β-葡萄糖苷酶的半理性設(shè)計(jì)

半理性設(shè)計(jì)是繼理性設(shè)計(jì)之后出現(xiàn)的一種酶的定向進(jìn)化方法,與酶的固定化、釀酒酵母展示技術(shù)相比而言,其優(yōu)勢(shì)是不需要高成本的固定材料和繁瑣的純化過(guò)程,同時(shí)避免了因柑橘加工過(guò)程中產(chǎn)生的酒精會(huì)抑制酵母生長(zhǎng)而對(duì)β-葡萄糖苷酶固定效果造成的影響[46]。其作用原理是對(duì)β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變以獲得可以在柑橘加工所處復(fù)雜環(huán)境條件下保持較高活性及穩(wěn)定性的酶[47]。近年來(lái),基于提高β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性、乙醇耐受性及低溫耐受性開(kāi)展了相關(guān)研究以期為半理性設(shè)計(jì)提供理論基礎(chǔ)。

3.4.1 葡萄糖耐受性

鑒于葡萄糖由于其反饋抑制作用會(huì)限制β-葡萄糖苷酶的實(shí)際應(yīng)用效果,基于在葡萄糖與β-葡萄糖苷酶互作機(jī)理,對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行定向改造非常重要。GIUSEPPE等[48]為探討GH1家族葡萄糖耐受性顯著高于GH3家族的問(wèn)題,通過(guò)分析比較2個(gè)家族β-葡萄糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)的差異得出活性位點(diǎn)的可及性和葡萄糖耐受性之間存在著明顯的相關(guān)性,GH3家族的β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性相比于GH1家族較低的原因在于其袋口寬大且催化通道較淺有助于葡萄糖分子更多地進(jìn)入到酶活性位點(diǎn)。此與KONAR等[49]、SUSHANT等[50]的研究結(jié)果相似,表明了活性位點(diǎn)袋口的寬窄與催化通道的長(zhǎng)短可能直接影響著葡萄糖進(jìn)入β-葡萄糖苷酶活性位點(diǎn)的難易程度,且當(dāng)葡萄糖、疏水性殘基積聚在活性位點(diǎn)袋口處時(shí)將會(huì)阻礙葡萄糖分子與活性位點(diǎn)結(jié)合,從而使得β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄糖的耐受性升高。因此,β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性取決于葡萄糖進(jìn)入β-葡萄糖苷酶活性位點(diǎn)的難易程度,可通過(guò)阻礙葡萄糖分子與活性位點(diǎn)結(jié)合來(lái)提高β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄糖的耐受性進(jìn)而在很大程度上保留酶活力。

3.4.2 乙醇耐受性

乙醇作為一種有機(jī)溶劑,β-葡萄糖苷酶的活性會(huì)隨著柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量的升高而降低。研究發(fā)現(xiàn),溶液里大部分酒類(lèi)酒球菌菌株中β-葡萄糖苷酶活性在酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到4%時(shí)已經(jīng)受到強(qiáng)烈抑制[51],而導(dǎo)致酶活性損失的潛在因素之一為β-葡萄糖苷酶的構(gòu)象隨著有機(jī)溶劑濃度的升高而發(fā)生了變化[52]。對(duì)此,提高β-葡萄糖苷酶乙醇耐受性可以通過(guò)對(duì)β-葡萄糖苷酶中穩(wěn)定性較差的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,加強(qiáng)氨基酸之間的疏水力和氫鍵來(lái)提高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)當(dāng)中的非共價(jià)相互作用力以使得β-葡萄糖苷酶對(duì)乙醇的耐受性增強(qiáng)[47]。此外,KARNAOURI等[53]研究用甲醇當(dāng)有機(jī)溶劑時(shí),β-葡萄糖苷酶能夠有效合成甲基-葡萄糖苷鍵,并且酶本身在體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇中具有較高的穩(wěn)定性,這表明了β-葡萄糖苷酶對(duì)乙醇的耐受性可能與其存在著更強(qiáng)的親核試劑發(fā)生的轉(zhuǎn)糖基化活性及轉(zhuǎn)糖苷能力有關(guān)。

3.4.3 低溫耐受性

柑橘酒的發(fā)酵溫度通常低于30 ℃,而β-葡萄糖苷酶活性的最適宜溫度通常高于45 ℃,這對(duì)適合于低溫發(fā)酵的柑橘酒而言是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的問(wèn)題,如何通過(guò)提高β-葡萄糖苷酶的低溫耐受性改善柑橘酒的風(fēng)味至關(guān)重要。研究人員嘗試從嗜冷和耐冷細(xì)菌中分離出屬于GH3[54]和GH1家族的幾種冷適應(yīng)β-葡萄糖苷酶,并通過(guò)對(duì)比嗜冷菌中的β-葡萄糖苷酶BglU與嗜溫及嗜熱菌中β-葡萄糖苷酶BglB和GlyTn的晶體結(jié)構(gòu)及編碼序列,將BglU結(jié)構(gòu)中特有的L3環(huán)縮短,其在低溫下的催化活性將會(huì)降低；若將299位置上的His突變?yōu)門(mén)yr,酶的最適溫度將會(huì)提高[55]。相反地,將BglB的Tyr301突變?yōu)镠is,酶的最適溫度將會(huì)降低[56]。SUN等[57]從海洋細(xì)菌中克隆了一個(gè)可以編碼冷適應(yīng)β-葡萄糖苷酶的新基因(Bgl)并置于大腸桿菌中表達(dá),且經(jīng)Ni2+層析純化,純化后的β-葡萄糖苷酶最適溫度為25～45 ℃,這可能是因?yàn)槠涮厥獾幕蚓幋a序列決定了其特有的結(jié)構(gòu),而這種結(jié)構(gòu)致使其擁有了較好的低溫耐受性,但對(duì)于純化后該β-葡萄糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究。

4 展望

香氣和苦味物質(zhì)作為柑橘汁品種的重要指標(biāo),使得β-葡萄糖苷酶在提升柑橘汁香氣和脫苦方面?zhèn)涫荜P(guān)注。然而,柑橘酒的研究難以像葡萄酒一樣進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化而是一直停留在試驗(yàn)階段,其原因不僅在于缺乏專(zhuān)屬酵母,導(dǎo)致柑橘酒風(fēng)味不佳及脫苦效果不理想,而且柑橘汁糖分較低不利于自然發(fā)酵。通過(guò)對(duì)β-葡萄糖苷酶的縱深研究可能會(huì)對(duì)柑橘加工產(chǎn)品品質(zhì)的提升帶來(lái)新的契機(jī)。因此,未來(lái)應(yīng)繼續(xù)著重于通過(guò)提高β-葡萄糖苷酶在復(fù)雜環(huán)境中活性及穩(wěn)定性,進(jìn)而提高柑橘加工產(chǎn)品香氣釋放和降低苦味來(lái)加深研究,這有助于為改善柑橘加工產(chǎn)品品質(zhì),并進(jìn)一步推進(jìn)增香技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。