基于數字化環(huán)介導等溫擴增技術的牛乳中大腸桿菌快速精準定量分析

易昌毓,羅自生,潘響亮,林星宇*

1(浙江工業(yè)大學 環(huán)境學院,浙江 杭州,310014) 2(浙江大學 生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江 杭州,310058)

在生產過程中極易被微生物污染從而導致牛乳變質,因此微生物超標在牛乳生產過程中是一個重要的衛(wèi)生安全問題[1]。大腸桿菌是乳品國家標準中規(guī)定菌群檢測項目的主要目標物,同時也是食品中糞源性污染衛(wèi)生細菌學指標[2]。常見的大腸桿菌檢測方法主要有平板計數法和分子生物學方法[3]。平板計數法是依據GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》[4]對乳品中大腸桿菌進行檢測,該方法操作簡單但會漏檢活的非可培養(yǎng)狀態(tài)菌[5]。同時,過長的檢測時間會導致檢測結果無法及時指導生產[6]。分子生物學方法中的聚合酶鏈式反應法(polymerase chain reaction,PCR)[7]及實時熒光PCR法(quantitative real-time PCR,qPCR)[8]可以縮短檢測時間并測定少量核酸,但無法進行絕對定量分析[9]。同時需要安裝大體積的儀器,無法用于食品現場快速檢測[10]。牛乳中大腸桿菌的有效控制,要求其得到快速準確的檢測,因此,迫切需要建立一種大腸桿菌快速檢測新方法以滿足市場需求。

環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本科學家NOTOMI等[11]率先建立的新型核酸擴增方法,該方法具有特異性強等特點[12],且在微生物檢測領域具有廣泛的應用前景[13]。LAMP反應產物的檢測可以通過肉眼觀察法觀察白色焦磷酸鎂沉淀[14]以及采用電泳法觀察梯形條帶[15],但肉眼觀察法易受觀察者主觀影響,電泳法操作繁瑣且會造成假陽性污染[16]。數字化LAMP雖可利用泊松分布的原理對核酸分子進行絕對定量,但通常需要使用微流控芯片進行檢測,操作復雜且耗時長[17]。

MITRA等[18]建立的擴增方法,即在聚丙烯酰胺水凝膠中進行數字PCR擴增并使擴增產物限制在模板附近從而實現絕對定量分析。本研究通過優(yōu)化數字化LAMP反應體系的各項參數,用于實現乳品中大腸桿菌的快速定量。由于水凝膠基質的限制作用,一個細菌的特定基因序列只會產生一個擴增子熒光亮點。因此,本研究使用熒光顯微鏡成像并通過擴增點計數來確定樣品細菌濃度,從而建立牛乳中大腸桿菌的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及試劑

大腸桿菌CICC 10907菌株、單核李斯特菌CICC 21633菌株、傷寒沙門氏菌 CICC 10871菌株,中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；牛乳樣品,當地市場。

10×Isothermal Amplification Buffer、Bst 2.0 WarmStartTMDNA聚合酶、MgSO4、dNTPs,New England Biolab公司；引物、DEPC水,生工生物工程(上海)股份有限公司；4臂-聚乙二醇-丙烯酸酯(分子質量10 kDa)、巰基-聚乙二醇-巰基(分子質量3 400 Da),Laysan Bio公司；Eva Green,上海閃晶分子生物科技有限公司；溶菌酶,Thermo Fisher Scientific公司；密封小室(frame-seal),Bio-rad公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),寶日安生物技術(北京)有限公司。

1.1.2 儀器與設備

MiniT-C型小型金屬浴,杭州奧盛儀器有限公司；Applied BiosystemsTM型實時PCR儀,Thermo Fisher Scientific公司；Leica DMi8型熒光顯微鏡,徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計

本研究中使用HILL等[19]設計的6條特異性引物并將其用于數字化LAMP檢測,包括2條內引物(FIP/BIP),2條外引物(F3/B3),2條環(huán)引物(Loop F/Loop B),詳見表1。

表1 大腸桿菌數字化LAMP引物Table 1 The E.coli primer for digital LAMP

將活化的大腸桿菌、單核李斯特菌、傷寒沙門氏菌分別接種于10 mL LB、BHI和TSB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min過夜培養(yǎng)12～14 h。細菌濃度可以通過將10 μL不同稀釋程度的菌液分散在LB營養(yǎng)瓊脂平板上,在37 ℃下孵育12 h并計數菌落形成單位(CFU)來量化。過夜培養(yǎng)后,取1 mL新鮮細菌菌液,細菌經玻璃珠振蕩破壁后,利用 PureLinkTMGenomic DNA Mini Kit試劑盒提取細菌DNA。

1.2.3 數字化LAMP反應體系及特異性

對于在聚丙烯酰胺水凝膠內部進行的LAMP反應,需要將2種聚丙烯酰胺水凝膠單體添加到LAMP反應體系中以確保水凝膠交聯,最終反應混合物(25 μL)由以下成分組成：1.6 mg 4臂-聚乙二醇-丙烯酸酯,1.1 mg 巰基-聚乙二醇-巰基,2.5 μL 10× Isothermal Amplification Buffer,6 mmol/L total MgSO4、1.4 mmol/L dNTPs,640 U/mLBst2.0 Warm Start聚合酶,1.6 μmol/L FIB和BIP,0.2 μmol/L F3和B3,0.4 μmol/L LF和LB,1×Eva Green和2.5 μL模板或真實樣品。

將上述25 μL水凝膠反應混合液加載到密封孵化小室中,蓋上蓋玻片,室溫下放置3～5 min使其交聯,并在小型金屬浴上進行等溫擴增反應。擴增反應結束后將載玻片置于熒光顯微鏡下觀察,使用Image J計數軟件對熒光擴增點進行計數。為了記錄實時擴增曲線,將水凝膠反應混合物添加到八聯管中,并使用實時PCR儀在65 ℃下孵育30 min,每隔1 min監(jiān)測反應的熒光強度。

1.2.4 數字化LAMP反應條件優(yōu)化

通過改變體系中環(huán)引物濃度(0、0.4、0.8 μmol/L)探究其對擴增反應的影響。同時在65 ℃條件下對水凝膠混合液分別加熱10、20、30 min 并記錄熒光點數目,探究時間對擴增點數目的影響,優(yōu)化反應時間以提高反應效率。

1.2.5 DNA熱變性對反應的影響

對DNA進行熱變性預處理,即在85和95 ℃條件下分別加熱2、5、8 min,加熱結束后置于冰盒中以保證DNA處于單螺旋狀態(tài),并進行數字化LAMP反應,通過記錄和比較熒光點數目探究DNA熱變性對反應的影響。

1.2.6 數字化LAMP反應檢測大腸桿菌及特異性

為了進一步減少繁瑣的實驗步驟,本實驗通過在水凝膠中加入溶菌酶和BSA,以有效裂解細菌細胞壁和防止細菌吸附到離心管管壁上,并直接進行細菌檢測。通過優(yōu)化溶菌酶和BSA濃度得到最準確的細菌數目,從而進行定量分析。

1.2.7 人工污染牛乳

在人工污染前,按照國標法檢測證實樣品不含大腸桿菌。然后對1 mL不含大腸桿菌的牛乳樣品污染不同濃度的大腸桿菌,依次為4.0×102～2.0×104CFU/mL。往水凝膠體系中加入2.5 μL人工污染牛乳樣品,此時每個實驗組中大腸桿菌的個數為1～50。

1.2.8 數字化LAMP反應特異性

為了探究反應的特異性,往水凝膠體系中分別加入相同濃度的大腸桿菌DNA、單核李斯特菌DNA和傷寒沙門氏菌DNA,在65 ℃條件下對水凝膠混合液加熱30 min并記錄熒光點數目。

1.2.9 數據處理與分析

所有實驗數據均以平均值±標準差表示,實驗重復3次。原始圖像用于數據分析,并通過Image J軟件測量熒光點數目。Origin Pro 9.0軟件用于統(tǒng)計分析和圖表繪制。對于圖7-e,使用線性函數y=ax+b擬合數據。

2 結果與分析

2.1 數字化LAMP檢測大腸桿菌方法的建立

如圖1所示,隨著反應的進行,水凝膠陽性對照樣品中熒光強度緩慢增加,當反應進行至6 min時,管內熒光強度開始大幅增加,反應至12 min時,熒光信號增加強度逐漸變緩直至反應結束,說明溶液中發(fā)生了擴增反應。同時,水凝膠陰性對照組熒光曲線一直處于相對平滑的狀態(tài),直到反應終止都沒有明顯變化,說明沒有發(fā)生擴增反應。該結果表明,水凝膠的加入不會影響LAMP擴增。

1-水凝膠陽性對照,DNA濃度為1.0×105 copy/mL；2-水凝膠陰性對照圖1 數字化LAMP檢測結果Fig.1 Detection results of digital LAMP

2.2 環(huán)引物濃度對數字化LAMP的影響

環(huán)引物濃度通常影響LAMP反應的效率。由圖2可知,隨著環(huán)引物濃度增加,反應出峰時間從15 min降至2 min,同時熒光信號達到最大值所用時間從20 min降至8 min。說明環(huán)引物濃度的增加可以提高反應效率,減少反應時間。

1～3 環(huán)引物濃度LF/LB由高到低分別為0.8、0.4 和0 μmol/L,DNA濃度為1.0×105 copy/mL圖2 環(huán)引物濃度對數字化LAMP的影響Fig.2 Impact of loop primer concentration on the digital LAMP

2.3 時間對數字化LAMP的影響

本實驗通過改變擴增時間來確定數字化LAMP反應中熒光擴增點數目的變化情況。如圖3所示,隨著擴增時間的增加,擴增點數目逐漸增大并在20 min達到最大值,而在此之后熒光擴增點的數目變化不大,這可能是因為在20 min左右反應已經基本完成擴增。本實驗中主要討論的是如何在較短的時間內如何更高效率檢測出大腸桿菌,因此,選擇擴增時間為20 min。

圖3 擴增時間對數字化LAMP擴增點數目的影響Fig.3 Impact of reaction time on the number of digital LAMP amplicon dots注:每個反應中大腸桿菌基因組的濃度相同且均為42 copies/μL

2.4 DNA熱變性對數字化LAMP的影響

為進一步優(yōu)化數字化LAMP擴增點的數目,對DNA進行熱變性預處理,即分別在85和95 ℃加熱不同時間,DNA雙鏈部分或全部解螺旋以便于促進擴增反應的進行。如圖4所示,隨著加熱時間的增長和加熱溫度的升高,擴增點數目均出現了不同程度的下降,這可能是因為過長的加熱時間和過高加熱溫度會對DNA造成破壞,從而影響擴增反應。

圖4 DNA熱變性對數字化LAMP擴增點數目的影響Fig.4 Impact of DNA denature on the number of digital LAMP amplicon dots注:每個反應中大腸桿菌基因組的濃度相同且均為100 copies/μL

2.5 溶菌酶對數字化LAMP的影響

為實現對大腸菌的直接檢測,往體系中加入溶菌酶水解細菌細胞壁,并對釋放的基因組進行直接擴增,同時將未添加溶菌酶的實驗組作為空白對照組。如圖5所示,添加溶菌酶實驗組擴增點數目與提取的DNA處理組擴增點數目十分接近,而未添加溶菌酶的空白對照組數目遠遠少于2個實驗組的擴增點數目,因此溶菌酶可用于細菌的裂解和直接擴增實驗。

a-DNA熱變性預處理；b-添加溶菌酶實驗組；c-未添加溶菌酶對照組圖5 溶菌酶對數字化LAMP的影響Fig.5 Impact of lysozyme on the digital LAMP注:每個反應中大腸桿菌的濃度相同且均為42 CFU/μL

2.6 BSA對數字化LAMP的影響

本實驗使用按DEPC水梯度稀釋的大腸桿菌菌液以及溶菌酶進行數字化LAMP反應，并對BSA質量濃度進行優(yōu)化。如圖6所示,隨著BSA質量濃度的增加,熒光擴增點的個數增加，實驗結果越接近給定菌液濃度,可信度越高,同時應盡量避免高質量濃度BSA抑制擴增反應,因此,選擇適宜的BSA質量濃度為1.0 mg/mL。

圖6 BSA對數字化LAMP擴增點數目的影響Fig.6 Impact of BSA concentration on the number of digital LAMP amplicon dots注:每個反應中大腸桿菌的濃度相同且均為20 CFU/μL

2.7 數字化LAMP檢測牛乳樣品中大腸桿菌及反應特異性

用優(yōu)化的方法對牛乳中大腸桿菌進行快速檢測。牛乳中菌液濃度與所檢測到的熒光點個數成線性關系,如圖7所示。該方法所得到的結果與平板培養(yǎng)法非常接近(R2=0.999 8)。同傳統(tǒng)平板計數法相比,本方法檢測可在20 min左右完成,靈敏度可降至單個細菌,大大縮短檢測周期而且操作簡便。同時在加入相同濃度的大腸桿菌DNA、單核李斯特菌DNA和傷寒沙門氏菌DNA后,僅有大腸桿菌DNA實驗組觀測到熒光點,如圖7-f所示,這是因為本實驗中所提供的引物序列主要用于檢測大腸桿菌,說明該方法具有很高的特異性。

a-1個大腸桿菌熒光圖；b-10個大腸桿菌熒光圖；c-25個大腸桿菌熒光圖；d-50個大腸桿菌熒光圖；e-菌液濃度和擴增點個數擬合圖；f-特異性圖7 數字化LAMP檢測牛乳中大腸桿菌關系圖及反應特異性Fig.7 Detection plot of digital LAMP amplicon dots derived from milk inoculated with E.coli and response specificity

本實驗建立的數字化LAMP可以快速準確定量樣品中大腸桿菌的數目,檢測限可低至0.4 CFU/μL,因此本研究所建立的一種基于數字化LAMP計數檢測牛乳中大腸桿菌的方法具有可行性。

3 結論

本研究利用LAMP反應產物在聚乙二醇水凝膠中發(fā)生數字化擴增并與熒光染料結合發(fā)出熒光的特點,并在擴增結束后通過熒光顯微鏡觀察到明顯的熒光擴增點,通過改變BSA質量濃度、擴增時間等條件優(yōu)化實驗結果,使用圖像處理軟件Image J 計數來實現絕對定量檢測和分析,建立了一種基于數字化環(huán)介導等溫擴增技術檢測大腸桿菌的方法。與普通基因檢測方法相比,本研究所提出的數字化LAMP方法特點是：(1)具有很高的特異性和靈敏度,可以達到單拷貝基因檢測的水平,實現DNA的絕對定量分析；(2)相比PCR,本技術不需要熱循環(huán),只需恒溫加熱即可;(3)不需要對細胞破碎以提取DNA,從而簡化實驗步驟,縮短了檢測周期,提高了檢測效率。通過對人工污染的樣品進行檢測，結果表明經過20 min就可完成牛乳中大腸桿菌的檢測。本研究探索了一種特異性強、靈敏度高、操作便捷的分子檢測大腸桿菌的技術,為大腸桿菌及其他細菌的快速檢測提供了新的發(fā)展方向。